草地早熟禾根際磷細菌的分離與鑒定

梁凈 張曉波 趙艷 許沛冬

摘要：利用選擇性培養基從草地早熟禾（Poa pratensis）根際土壤中篩選到8株有機磷細菌和7株無機磷細菌，根據其形態學和生理生化等特性進行了鑒定。結果表明，有機磷細菌菌株PO1、PO3、PO4、PO5鑒定為Bacillus cereus（蠟狀芽孢桿菌），菌株PO2、PO6和PO7鑒定為Bacillus megaterium（巨大芽孢桿菌），菌株PO8為Bacillus badius（栗褐芽孢桿菌），而本試驗篩選到的無機磷細菌菌株均為Pseudomonas sp.（熒光假單胞菌）。

關鍵詞：草地早熟禾；磷細菌；分離；鑒定

中圖分類號： S688.406文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0314-03

收稿日期：2013-10-22

基金項目：海南省自然科學基金（編號：312060）。

作者簡介：梁凈（1991—），男，瑤族，主要從事草坪管理相關研究。E-mail：airstreet00@163.com。

通信作者：張曉波，博士，副教授。E-mail：angiaoo@126.com。磷是植物生長發育必需的重要營養元素，但我國目前土壤缺磷面積較大，增加土壤磷素的主要途徑依然是靠草地生產中施用的磷肥。由于施入可溶性的磷肥會使農田大部分迅速轉變為作物難以吸收的無效磷，最終導致作物對磷肥的當季利用率很低[1-2]。對于我國而言，提取固定土壤中釋放的無效磷，對提高土壤可利用磷素含量、減少磷肥使用具有重要的意義[2]。磷細菌是可以將土壤中有機磷和難溶性無機磷轉化為可溶性無機磷的細菌，可分為解磷菌（有機磷細菌）和溶磷菌（無機磷細菌）兩大類[3-5]。研究證明，土壤中存在大量微生物，能將植物難以吸收利用的磷轉化為可吸收利用的形態[6]，對于將無效磷轉變為有效磷有著至關重要的作用。

草地早熟禾（Poa pratensis）是常用的冷季型草坪草，其綠期長、適應性強、分布廣，抗霜凍及耐寒能力強，對于北方城市草坪美化、綠化有重要意義。肥料的合理施用對其生長及發揮生態效益具有重要作用，其中磷肥對草坪草的重要作用主要表現在抗性方面[7-9]。我國目前磷礦資源貧乏，生產能力低，使用的磷肥主要依靠外國進口，因此，研發生物磷肥，既可提高作物產量，又可保護土壤資源，對于農業生產可持續發展有著重要意義。根據生態學原理，特定種類的有益菌株，從原習居地取樣篩選，不僅能滿足植物的專一性，且能獲得較高成功率。本研究利用選擇培養基，從草地早熟禾根際土壤樣品中對磷細菌進行分離、純化、鑒定，對于有效利用磷細菌菌株及調控植物根系微生物系統有重要意義，可為研制專用生物磷肥提供必要實踐及理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試土樣基本特征草地早熟禾根際磷細菌土樣取自山西農業大學校園內年限為3年的健康草地早熟禾根際土壤，其pH值為8.24，有機質含量為8.59 g/kg，全鉀為 3.18 g/kg，全磷為0.21 g/kg，全氮為0.17 g/kg，速效鉀為90.67 mg/kg，速效磷為60.37 mg/kg。

1.1.2培養基蒙金娜有機培養基[10-11]：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO4 0.5 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，卵磷脂 0.2 g，CaCO3 1.0 g，酵母粉 0.5 g，瓊脂20 g，總體積1 000 mL（蒸餾水補足），pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

Pikovaskaias（PKO）無機培養基[10-11]：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.036 g，Ca3（PO4）2 2.0 g，瓊脂20 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，總體積1 000 mL（蒸餾水補足），pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

Luria-Bertani（LB）培養基[12]：蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，NaCl 8.0 g，瓊脂20 g，總體積 1 000 mL（蒸餾水補足），pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

土壤礦物：去除有機殘體的土壤，取土樣3 g，加入20% HCl 30 mL，煮沸30 min，過濾，用蒸溜水淋洗至無氯離子反應。

1.2方法

1.2.1根際土壤的采集采樣區為山西農業大學校園內健康的草地早熟禾草坪，取草坪區域良好處作為標準樣地（3 m×3 m），在每個標準樣地內按“S”形隨機選擇5株草地早熟禾植株，先除去其表層的枯草及落葉，隨后將整個植株帶根系慢慢挖出，輕輕抖落根系上的大塊土壤，收集附于植株根系表面約2 mm左右的土壤，分別將采集到的根際土樣裝入經過高壓消毒的無菌紙袋，并在袋上注明采集日期以及土樣號，帶回實驗室立即進行試驗。

1.2.2磷細菌分離稱取各根際土壤樣品1 g，在無菌條件下操作，分別取9 mL無菌水和8粒無菌玻璃珠裝入 250 mL 的三角瓶中，置于恒溫振蕩機上25 ℃ 、170 r/min振蕩 20 min，得到10-1稀釋度的土壤懸液。用無菌吸管分別吸取10-1稀釋度的土壤懸液1 mL并注入裝有9 mL無菌水的三角瓶中作10-2稀釋度的土壤懸液，隨后再用無菌吸管吸取10-2稀釋度的土壤懸液1 mL并注入裝有9 mL無菌水的試管中作10-3稀釋度的土壤懸液，依此類推，分別得到10-4、10-5、10-6稀釋度的各土樣懸液。用移液管吸取上述稀釋度為10-4、10-5、10-6的各土壤懸液，每個稀釋度設3個重復。稀釋平板法，有機磷細菌菌株于28 ℃下培養 24 h，無機磷細菌菌株在28 ℃下培養2～4 d，分別觀察其菌落形態。由于有機磷細菌能分解卵黃中的有機磷產生磷酸，無機磷細菌能分解磷酸鈣鹽產生有機酸或無機酸，使難溶性的磷酸鈣鹽轉化為可溶性磷酸鹽，所以在其菌落的周圍可形成一個透明圈。挑選周圍產生透明圈的單菌落，接入牛肉膏蛋白胨斜面培養基培養，在LB平板上2次活化再接入牛肉膏蛋白胨斜面保存。

1.2.3磷細菌的形態及生理生化特性鑒定（1）革蘭氏染色：取用24 h菌齡的純培養物制片染色后通過鏡檢觀察其染色結果。（2）芽孢染色：采用淀粉銨鹽培養基[13]培養 3 d，用芽孢染色法[13]觀察其形狀及著生位置。（3）鞭毛染色：取連續傳代培養2次的菌種，接種至新鮮配制的瓊脂斜面上（有冷凝水），30 ℃培養24 h，觀察硝酸銀染色的結果。（4）菌體大小測定：簡單染色后用數碼顯微鏡觀測菌體長及寬。（5）液體培養特征：將供試菌株接種在硅酸鹽細菌液體培養基中，置于30 ℃恒溫下培養6 d，觀察是否形成菌環、菌膜、渾濁或沉淀特征。（6）菌落特征：用接種環接菌，對制成的平板進行劃線，置于30 ℃恒溫下培養5～6 d，觀察并且描述其菌落大小、顏色、形狀、是否黏稠、是否透明。（7） 過氧化氫酶試驗：將供試菌株活化后（培養18～24 h），有機磷細菌菌株接種于蒙金娜有機培養基斜面上，無機磷細菌菌株接種于PKO無機培養基斜面上，分別置于30 ℃下培養，7 d 后，在豐滿的菌苔上滴加3% H2O2 1 mL，立即檢查其結果，5 min 內如出現氣泡則為陽性反應，記錄為“+”，否則為“ -”。（8） 其他生化性狀：甲基乙酰甲醇試驗（V.P試驗）、酪素水解、淀粉水解、產吲跺試驗、卵磷脂酶、硝酸鹽還原試驗等均按常用方法[14]進行。

2結果與分析

2.1菌株的分離

用接種環取上述分離到的各類菌株的純培養物，再以平板劃線法將其分別接種于平板培養基上，置于28 ℃的培養箱中培養24～48 h。視菌落生長情況，在蒙金娜有機培養基挑出8株有機磷細菌菌落，分別編號為PO1至PO8。在PKO培養基挑出7株無機磷細菌菌落，分別編號為PM1至PM7。然后對挑出的菌株進一步分離純化后，對菌株的形態和生理生化特征進行鑒定。

2.2菌株的培養特征

將分離純化得到的8株有機磷菌株和7株無機磷菌株，分別接種在分離培養基平板上30 ℃條件下培養48 h，發現有機磷菌株（表1）在蒙金娜有機培養基上菌落形狀不一，主要呈現乳白色或淺黃色，像半粒玻璃珠平貼于平板上；菌落凸起呈圓形或不規則，邊緣完整或鋸齒狀，表面光滑，濕潤有光澤，黏稠，富有彈性。無機磷菌株（表2）在PKO培養基上形狀為圓形，呈現色澤不一，邊緣完整或鋸齒狀，表面光滑，濕潤有光澤，黏稠，富有彈性。在液體培養條件下，分離的菌株能在培養液底部形成透明度不一的霧狀沉淀，沉淀膠結成團，不易搖散，培養液渾濁度不一。表1草地早熟禾根際有機磷細菌在蒙金娜有機培養基上的菌落形態

菌株號形狀隆起度透明度邊緣顏色表面狀況生長速度PO1不規則凸起不透明鋸齒狀淺黃色較濕潤較慢PO2圓形凸起不透明完整白色濕潤較慢PO3不規則凸起不透明完整乳白很濕潤較快PO4不規則平坦不透明波浪狀淺黃色很濕潤較慢PO5不規則凸起稍透明完整乳白較濕潤較快PO6圓形平坦不透明波浪狀乳白較濕潤較快PO7圓形平坦不透明完整白色濕潤較慢PO8圓形凸起不透明鋸齒狀灰白色很濕潤較快

菌株號形狀隆起度透明度邊緣顏色表面狀況生長速度PM1圓形凸起不透明鋸齒狀乳白很濕潤較快PM2圓形平坦不透明鋸齒狀灰白色很濕潤較慢PM3圓形凸起透明完整乳白很濕潤較快PM4圓形平坦不透明完整淺黃色很濕潤較慢PM5圓形凸起稍透明完整乳白較干燥較快PM6圓形平坦透明齒狀無色較干燥較快PM7圓形平坦透明完整無色很濕潤較慢

2.3菌株的形態

2.4菌株的生理生化特征

2.5磷細菌的鑒定

3結論

目前微生物肥料的應用與開發尚有許多不足，但此方面的研究對啟動土壤磷庫資源、減少化肥的投入及環保等諸多方面具有深遠的意義。本研究通過對8株有機磷菌株和7株無機磷菌株的細胞形態及生理生化特征的初步考察，對照《常見細菌系統鑒定手冊》[14]及有關文獻報道[17- 19]，可以確定8株有機磷細菌中的PO1、PO3、PO4、PO5為Bacillus cereus（蠟狀芽孢桿菌），PO2、PO6和PO7為Bacillus megaterium（巨大芽孢桿菌），PO8為Bacillus badius（栗褐芽孢桿菌），而7株無機磷菌株均為Pseudomonas sp.（熒光假單胞菌）。分析結果表明有機磷細菌菌株為芽孢桿菌屬，無機磷細菌為假單胞菌屬。通過此次研究可知山西農業大學校園內草地早熟禾根系常見的磷細菌種類，為將來更好地挖掘草地早熟禾微生物的解磷潛能，對開發高效微生物肥料，提高土壤中有效磷的含量、減少化學肥料的使用、改善土壤環境方面具有積極作用，對探索草地早熟禾根際土壤的潛在肥力、發展草地早熟禾土壤地可持續農業具有一定的理論與實際作用。關于各磷細菌菌株的解磷機制和在土壤中的活動規律有待于進一步研究。

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