凝血因子、易栓癥篩查三項及血管性血友病因子抗原的臨床檢測性能評價

壽瑋齡，吳 衛，范連凱，謝 田，崔 巍

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院檢驗科，北京 100730

·論 著·

凝血因子、易栓癥篩查三項及血管性血友病因子抗原的臨床檢測性能評價

壽瑋齡，吳 衛，范連凱，謝 田，崔 巍

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院檢驗科，北京 100730

目的 對血栓與止血特殊項目的臨床檢測進行全面性能評價，以期為臨床提供可靠的檢測結果。方法 按照美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)EP5-A2、EP9-A2文件及《衛生部臨床血液學檢驗常規項目分析質量要求WS/T 406-2012文件》標準，對本實驗室ACL TOP 700全自動凝血分析儀測定凝血因子(FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ)、易栓癥篩查三項(蛋白S、蛋白C及抗凝血酶-Ⅲ)和血管性血友病因子抗原(von Willebrand factor antigen, vWF:Ag)共12個項目的準確度、不精密度、攜帶污染率、線性、方法學比對及參考范圍進行全面性能評估。結果 美國病理學家協會提供的12個項目質評物檢測結果與靶值相比，除蛋白C低值外偏差均小于15%。8個凝血因子批內不精密度為1.7%～4.4%，均小于4.5%；批間不精密度為2.2%～7.5%，均不大于7.5%。易栓癥篩查三項的批內不精密度為1.0%～7.0%；批間不精密度為1.5%～10.5%。vWF:Ag批內不精密度為2.2%～3.1%，批間不精密度為2.1%～4.1%。12個項目攜帶污染率為0～2.63%，均小于3%。線性驗證實驗結果顯示蛋白S、蛋白C、抗凝血酶-Ⅲ及vWF:Ag相關系數為0.982～0.988，均≥0.975。ACL TOP 700與參比檢測系統進行比較，12個項目檢測結果的相關系數均≥0.975，一致性較好。廠商提供的參考范圍均適用于本實驗室。結論 ACL TOP 700全自動凝血分析儀對血栓與止血特殊項目檢測的準確度、不精密度、攜帶污染率、現行線性范圍及參考范圍驗證等性能評價良好，適用于臨床標本檢測。

凝血分析儀；血栓與止血；性能

MedJPUMCH,2014,5(3):278-282

ACL TOP 700全自動凝血分析儀是美國Instrument Laboratory公司生產的多參數凝血分析儀，可通過凝固法、發色底物法和免疫比濁法進行檢測。本實驗室根據美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)EP5-A2和EP9-A2文件[1- 2]，以及《衛生部臨床血液學檢驗常規項目分析質量要求WS/T 406- 2012文件》要求，全面驗證即將投入使用的ACL TOP 700全自動凝血分析儀性能，以評估該儀器對凝血因子(FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ)、血管性血友病因子抗原(von Willeband factor antigen，vWF:Ag)和易栓癥篩查三項：蛋白S(protein S, PS)、蛋白C(protein C, PC)、抗凝血酶-Ⅲ(anti-thrombin Ⅲ,AT-Ⅲ)等血栓與止血特殊項目的檢測是否可以用于臨床標本的檢測。

材料和方法

儀器與試劑

ACL TOP 700全自動凝血分析儀及其配套試劑、定標品與質控品為美國Instrument Laboratory公司產品，STA-R全自動凝血分析儀及其配套試劑與質控品為法國Diagnostic Stago公司產品。

標本

枸櫞酸鈉(109 mmol/L)抗凝新鮮靜脈血標本，抗凝劑與標本比例為1∶9，在1500×g下離心10 min，取上層血漿，在2 h內完成檢測，或于-80 ℃分裝凍存，凍存標本檢測前于37 ℃水浴15 min快速復溫。標本無溶血、凝固、乳糜現象，紅細胞比容<55%。

測定方法

凝血因子及PS測定方法為凝固法，PC、AT-Ⅲ為發色底物法，vWF:Ag為免疫比濁法。

評估指標

準確度：采用美國病理學家協會(College of American Pathologists, CAP)室間質評物(CGE-A)進行單次檢測，計算每份樣本檢測結果與靶值間的相對偏差。相對偏差(%)=(測定值-靶值)/靶值×100%。

攜帶污染率(carryover rate, CR)：取高值臨床樣本一份，連續測定3次；再取低值臨床樣本一份，連續測定3次。將測定結果記為H1、H2、H3和L1、L2、L3，按公式CR=|L1-L3|/(H3-L3)×100%計算。

線性驗證：取高濃度混合血漿(H)、低濃度混合血漿(L)各一份，按5H、4H+L、3H+2L、2H+3L、H+4L、5L配成6個濃度梯度的混合血漿，按濃度從低到高各測定2次。其預期濃度按照公式：x=(CL×VL+CH×VH)/(VL+VH)計算。按照CLSI EP6-A文件提供的方案初步檢查數據，檢查離群值，判斷重復性，根據檢測結果進行線性回歸分析。之后進行多元線性回歸，將結果分別擬合一次、二次、三次多項式，并進行評價。判斷標準：線性回歸方程的斜率在1±0.05范圍內，相關系數r≥0.975。

比對：收集40例不同濃度血漿標本，凝血因子與外院同型號儀器進行比對，PS、PC、AT-Ⅲ及vWF:Ag分別在評估儀器和STAGO系統上進行比對。參考CLSI EP9-A2文件提供的方案，分別以參比儀器測定結果為X，以評估系統測定結果為Y，繪制散點圖及偏倚圖，目測評價，顯示回歸方程Y=a+bX，同時評價不同檢測系統的平均百分偏差、相關系數(r)。

參考范圍驗證：收集40例表觀健康人枸櫞酸鹽抗凝靜脈血，覆蓋各年齡段，男女比例各半。測定待驗證項目，將檢測結果按照大小排序并計算極差R，然后分別計算最大值和最小值與其相鄰數值之差D；若D/R≥1/3，則將最大值或最小值視為離群值予以剔除；將余下數據重復前述步驟進行離群值檢驗，直至剔除所有離群值。同時應另外選擇符合要求的個體以補足40例，確保檢測結果不含離群值。判斷標準：將40個驗證數據與參考區間進行比較，超出參考區間的數據≤4個(即超出參考區間的檢測數據個數≤10%)時，驗證通過。其中，vWF:Ag參考范圍按照O型與非O型血型分別進行驗證。

統計學處理

使用SPSS 17.0軟件完成相關分析、回歸分析、重復測量方差分析及一致性檢驗，檢驗水準α=0.05。

結 果

準確度

CAP質評物檢測結果與靶值相比，除PC低值外，其余各項相對偏差均小于15%(表1)；12個項目檢測結果均在CAP回報給定允許范圍內。

不精密度評價

8個凝血因子批內不精密度及批間不精密度≤7.5%；易栓癥篩查三項批內不精密度為1.0%～7.0%，批間不精密度為1.5%～10.5%；vWF:Ag批內不精密度為2.2%～3.1%，批間不精密度為2.1%～4.1%(表2、3)。

攜帶污染率

凝血因子攜帶污染率為0.11%～2.63%，易栓癥篩查三項攜帶污染率為0～1.12%，vWF:Ag攜帶污染率為0.33%，均小于3%。

線性

PS、PC、AT-Ⅲ及vWF:Ag數據組中無明顯離群值，最佳擬合方程為一次多項式，回歸方程中b在0.99～1.03之間，a與0差異無統計學意義(P>0.05)；相關系數在0.982～0.988之間，均≥0.975。其中AT-Ⅲ預測值與實測值見圖1。

表 1 凝血因子、易栓癥篩查三項和vWF:Ag準確度結果

PS：蛋白S；PC：蛋白C；AT-Ⅲ：抗凝血酶-Ⅲ；vWF:Ag：血管性血友病因子抗原

表 2 凝血因子八項批內不精密度及批間不精密度

CV：變異系數

表 3 易栓癥篩查三項及vWF:Ag批內不精密度及批間不精密度

PS、PC、AT-Ⅲ、vWF:Ag：同表1；CV：同表2

方法學比對

凝血因子檢測在同系統間，易栓癥篩查三項、vWF:Ag檢測在不同系統間比較，r均≥0.975，不同儀器系統間一致性較好，平均百分偏差(%)除FⅤ(15.5%)及AT-Ⅲ(15.2%)外均小于15%(表4)。

圖 1 AT-Ⅲ線性驗證

項目r偏差(%)凝血因子FⅡ0.993-8.5FⅤ0.98315.5FⅦ0.9983.7FⅧ0.9753.9FⅨ0.993-12.6FⅩ0.998-11.7FⅪ0.9897.7FⅫ0.9907.4易栓癥篩查三項PS0.9753.5PC0.9933.3AT-Ⅲ0.98315.2vWF:Ag0.9759.3

PS、PC、AT-Ⅲ、vWF:Ag：同表1

參考范圍驗證

40例表觀健康人12個項目檢測結果均有大于等于90%在試劑說明書提供參考范圍內。其中，20例O型表觀健康人vWF:Ag檢測結果為48.4%～202.3%，2例超出范圍(41.1%～125.9%)；20例A+B+AB型表觀健康人vWF:Ag檢測結果為57.7%～203.8%，2例超出范圍(61.3%～157.8%)。

討 論

凝血因子(FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ)活性和易栓癥篩查(PS、PC、AT-Ⅲ)項目是進一步確診凝血系統和抗凝系統相關疾病的實驗，vWF:Ag是血管性血友病診斷的重要指標；同時出凝血機制異常也與腫瘤等其他疾病的發生發展密切相關[3]，血栓與止血特殊項目檢測具有十分重要的臨床意義。良好的檢測系統是準確結果的保證，國內尚未見血栓與止血特殊項目性能驗證的相關文獻報道，國外文獻亦未見全面項目的相關報道。

本研究驗證的12個項目的CAP質評物檢測結果均在CAP回報范圍內，除PC低值外，其余各項與靶值相比偏差均小于15%。在CAP回報結果中僅FⅧ、FⅨ和AT-Ⅲ三項進行了檢測系統區分，其余各項為全球所有實驗室回報結果計算均值，可能會使偏差大于同系統間的實際偏差。同時，《WS/T 406-2012文件》規定準確度驗證應至少使用5份質評物，但現有CAP質評物僅2份，需進一步完善評價結果。

本研究批內與批間不精密度與國外文獻報道基本一致[4]，但PS批內不精密度、批間不精密度高于其他項目，這與其試劑穩定性有關。PS測定試劑的機上有效時間為1 h，乏PS血漿的機上有效時間為4 h，且試劑配制過程對檢測結果影響較大，提示在常規工作中需注意PS相關檢測試劑的配制及使用時間，減少因試劑原因導致的檢測結果假性降低。必要時可在檢測過程中增加質控頻次，以保證檢測結果的準確性。同時，實驗室工作人員應明確本實驗室所檢測的PS抗原為血漿中總PS還是游離PS。

ACL TOP 700與運行良好的其他檢測系統進行比較，12個項目檢測結果的相關系數r均≥0.975，一致性較好。文獻報道凝血功能分析的系統差異僅見于凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間、纖維蛋白原等初篩項目[5]，少有特殊項目的分析。不同檢測系統間APTT試劑激活劑種類的不同(鞣花酸、硅藻土)可影響FⅧ、FⅨ、FⅪ及FⅫ的檢測結果；檢測原理的不同如磁珠法還是光學法，散射光還是透射光，也會影響到檢測結果[6]。對于不同的檢測系統，提高對試劑性能和溯源性的要求，有利于減少系統間差異。

廠商試劑說明書提供的參考范圍均適用于本實驗室。需注意的是vWF:Ag參考范圍應按血型劃分[7]，不可籠統只取一個參考范圍，在臨床診斷血管性血友病過程中要充分考慮ABO血型系統對vWF:Ag的影響。

綜上，ACL TOP 700全自動凝血分析儀血栓與止血特殊項目檢測攜帶污染率、現行線性范圍及參考范圍驗證等性能評價良好，適合臨床標本檢測。本研究性能驗證數據與國外文獻基本一致，但目前血栓與止血特殊項目準確度和不精密度性能驗證及比對等要求國內外均無相關標準，還需相關組織進一步完善和確認上述項目的性能驗證標準。

[1]National Committee for Clinical Laboratory Standards. Evaluation of precision performance of quantitative measurement methods; Approved guideline. EP5-A2 [S]. Wayne, PA: NCCLS, 2004.

[2]National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method comparison and bias estimation using patient samples; Approved guideline. EP9-A2 [S]. Wayne, PA: NCCLS, 2002.

[3]壽瑋齡,崔巍.惡性腫瘤出凝血異常機制[J].協和醫學雜志, 2012, 4: 482- 486.

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Performance Evaluation of Clinical Detection of Coagulation Factors, Protein S,Protein C, Anti-thrombin Ⅲ, and von Willebrand Factor Antigen

SHOU Wei-ling, WU Wei, FAN Lian-kai, XIE Tian, CUI Wei

Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Beijing 100730, China

CUI Wei Tel: 010-69159713，E-mail：cuiw@pumch.cn

Objective To conduct a comprehensive performance evaluation of fully automated coagulation analyzer in testing coagulation factors, protein S(PS), protein C(PC), anti-thrombin Ⅲ (AT-Ⅲ), and von Willebrand factor antigen (vWF:Ag). Methods According to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP5-A2, EP9-A2, and WS/T 406-2012 specifications, coagulation factors(FⅡ, FⅤ, FⅦ, FⅧ, FⅨ, FⅩ, FⅪ, and FⅫ), PS, PC, AT-Ⅲ, and vWF:Ag were detected in the apparatus to evaluate the accuracy, within-run and between-run imprecisions, linear range, carryover rate, method comparisons, and reference range of the ACL TOP 700 coagulation analyzer. Results The instrument had high accuracy and precision, a good linear range, and low carryover rate (0-2.63%, <3%). The biases of the 12 College of American Pathologists (CAP) controls compared with the target value were all less than 15%, excepting the low value of PC. The within-run imprecisions of 8 coagulation factors were 1.7%-4.4%, and the between-run imprecisions were 2.2%-7.5%. The within-run imprecisions of 3 thrombophilia screen tests and vWF:Ag were 1.0%-7.0% and 2.2%-3.1%, and he between-run imprecisions were 1.5%-10.5% and 2.1%-4.1%, respectively. The carryover rates of the 12 items ranged from 0 to 2.63%. Results of liner verification test showed the correlation coefficients of PS, PC, AT-Ⅲ, and vWF:Ag were 0.982-0.988. Results of method comprisons showed the correlation coefficients of ACL TOP 700 and other coagulation analyzer were more than 0.975, and the recommended reference ranges of all the 12 items were appropriate for our laboratory. Conclusions ACL TOP 700 coagulation analyzer has a good performance in accuracy, imprecision, carryover rate, linear range, and method comparison. It is suitable for detection of clinical specimens.

coagulation analyzer; thrombosis and homeostasis; performance

崔 巍 電話：010-69159713，E-mail：cuiw@pumch.cn

R446.11

A

1674-9081(2014)03-0278-05

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.03.007

2014- 05- 04)