因血小板減少血涂片復(fù)檢出瘧原蟲

王 庚，陳 倩，王 欣，吳 衛(wèi)，張建平，崔 巍

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科， 北京 100730

·短篇論著·

因血小板減少血涂片復(fù)檢出瘧原蟲

王 庚，陳 倩，王 欣，吳 衛(wèi)，張建平，崔 巍

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科， 北京 100730

血小板減少；間日瘧原蟲；惡性瘧原蟲；血常規(guī)復(fù)檢規(guī)則

近年來，自動化血細胞分析復(fù)檢工作的普遍開展，不但提高了血常規(guī)結(jié)果的可靠性，也提高了血液寄生蟲的檢出率，尤其是瘧原蟲的檢出。本文報告筆者通過血常規(guī)復(fù)檢發(fā)現(xiàn)的5例瘧原蟲病例的形態(tài)學(xué)和血常規(guī)特點。

資料和方法

對象

5例患者于2011年7月至2014年1月就診于北京協(xié)和醫(yī)院，其相關(guān)生活史及臨床表現(xiàn)如下：

病例1，男，34歲，7月上旬到內(nèi)蒙古出差，同寢室室友出現(xiàn)高熱寒戰(zhàn)癥狀，回京后半月余因發(fā)熱、寒戰(zhàn)，就診于本院感染內(nèi)科，發(fā)熱特點為隔日發(fā)熱，時間為19 ∶00至20 ∶00。

病例2，男，46歲，于非洲和東南亞旅游歸來后發(fā)熱，就診于本院急診科。主訴在非洲時曾被蚊蟲叮咬，但未服用國家配發(fā)的抗瘧藥。

病例3，男，54歲，于坦桑尼亞工作歸來后發(fā)熱、驚厥，并被診斷為重型肺炎，因昏迷就診于本院急診科。

病例4，男，43歲，所羅門群島人，來我國后出現(xiàn)發(fā)熱、上呼吸道感染癥狀，就診于本院急診科。

病例5，男，50歲，非洲某國來華工作外交官，來京1周后出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)，就診于本院急診科。

儀器和試劑

Sysmex XE 5000全自動血細胞分析儀、Sysmex SP 1000全自動推片染片機，均為日本Sysmex公司生產(chǎn)。瑞士吉姆薩染色試劑(A、B液)，為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。80i型普通光學(xué)顯微鏡，為日本Nikon公司產(chǎn)品。CLINITEK 500尿液干化學(xué)分析儀、Dimension EXL with LM全自動整合式生化分析儀，為德國SIEMENS公司產(chǎn)品。

血細胞形態(tài)學(xué)檢查

5例患者血常規(guī)標本在全自動血細胞分析儀上檢測，觸發(fā)血常規(guī)復(fù)檢規(guī)則[1- 2]，經(jīng)自動推片染片機染色后進行血涂片復(fù)檢，于顯微鏡下觀察。

結(jié) 果

血常規(guī)主要參數(shù)

5例患者均表現(xiàn)為血小板減少，血小板計數(shù)(16～48)×109/L；4例白細胞正常，1例輕度降低；紅細胞均正常；4例血紅蛋白正常，1例輕度降低(表1)。

血涂片鏡檢結(jié)果

病例1和4可見間日瘧原蟲環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體及配子體(圖1)，2例患者紅細胞感染間日瘧原蟲后均發(fā)生腫脹且紅細胞上可見薛氏小點。

表 1 5例患者血常規(guī)主要參數(shù)

RBC：紅細胞；HGB：血紅蛋白；WBC：白細胞；PLT：血小板

病例2、3和5可見惡性瘧原蟲環(huán)狀體(圖2)，病例2可在外周血找到罕見的未成熟裂殖體(圖3)，該3例患者紅細胞感染惡性瘧原蟲后未發(fā)生腫脹。

病例5在急診科進行血小板復(fù)檢采用的是顯微鏡下手工計數(shù)法，經(jīng)血小板稀釋液稀釋后將血液標本充入計數(shù)板，血小板計數(shù)結(jié)果為124×109/L，與儀器法檢測血小板計數(shù)結(jié)果38×109/L相差甚遠(圖4)。進一步采用血液標本推片、染色后復(fù)檢，在血液標本中找到大量惡性瘧原蟲環(huán)狀體。

圖 1 間日瘧原蟲形態(tài)(箭頭)A.配子體；B.環(huán)狀體；C.滋養(yǎng)體；D.裂殖體

圖 2 惡性瘧原蟲環(huán)狀體形態(tài)A.薄血膜；B.厚血膜

討 論

近兩年，本院收治的發(fā)熱患者中瘧原蟲檢出概率明顯高于10年前，且所檢出的瘧疾患者均為輸入性，為非洲、東南亞各國來華工作者或旅游歸來者。雖然我國為赴非洲人員在出國前均配發(fā)了抗瘧藥物，但個別感染者在當?shù)乇晃孟x叮咬后并未及時服藥，而在歸國后不久出現(xiàn)癥狀并確診為瘧疾，此類患病者屢見不鮮。

瘧疾患者脾臟腫大、脾功能亢進、脾臟吞噬能力顯著增強[3]。惡性瘧原蟲引起的脾腫大最為顯著，間日瘧和三日瘧患者脾腫大程度較輕；各類瘧疾患者，因脾功能亢進而出現(xiàn)血小板減少，故臨床上可通過血涂片復(fù)檢血小板而發(fā)現(xiàn)瘧原蟲感染。本組5例患者均在做血常規(guī)檢測時，因血小板減少觸發(fā)血常規(guī)復(fù)檢規(guī)則(血小板<80×109/L)進行血涂片復(fù)檢發(fā)現(xiàn)瘧原蟲感染。

圖 3 惡性瘧原蟲未成熟裂殖體及配子體形態(tài)A.環(huán)狀體；B.未成熟配子體；C、D.未成熟裂殖體

圖 4 惡性瘧原蟲形態(tài)學(xué)檢測圖 A.血小板稀釋液充入計數(shù)板中的惡性瘧原蟲及血小板，兩者很難區(qū)分(紅色箭頭)；B.厚血膜涂片中的惡性瘧原蟲(綠色箭頭)；C.薄血膜涂片中的惡性瘧原蟲(綠色箭頭)

瘧原蟲與其他形態(tài)相近的血液內(nèi)寄生蟲的鑒別要點：(1)瘧原蟲均為紅細胞內(nèi)感染；(2)使用瑞氏吉姆薩染色方法時，瘧原蟲的核染紫紅色，胞漿染藍色；(3)瘧原蟲胞漿內(nèi)可見瘧色素顆粒；(4)被感染的紅細胞可有形態(tài)學(xué)改變。目前WHO推薦的瘧原蟲染色方法是吉姆薩染色，在此染色條件下間日瘧、惡性瘧、三日瘧和卵形瘧的瘧色素顆粒分別呈現(xiàn)金棕色、粗黑色、明顯而粗大的深棕色和明顯的深棕色。瘧色素顆粒分布和排列方式是瘧原蟲發(fā)育不同時期的鑒別要點之一，但在鑒別瘧原蟲蟲種和原蟲發(fā)育的不同時期，瘧色素顆粒的顏色并不是唯一的鑒別要點。國內(nèi)標準要求將厚、薄兩種血膜涂在同一張玻片上，染色前需用甲醇固定薄血膜，操作起來相對繁瑣。同一張玻片制作兩種血膜標本的制作模式，所需血量相對較少，而對于提高陽性檢出率這一點，血量減少無疑是一個較大的影響因素。鑒于此，本實驗室通常采用瑞氏吉姆薩混合染色，該方法既利于瘧原蟲染色，也利于血細胞染色，面對未明確診斷為瘧疾的血液標本，在查找瘧原蟲的同時觀察患者的血細胞形態(tài)，可使臨床檢驗工作更加完善而充分。用3張玻片制作1張厚血膜和2張薄血膜，油鏡下觀察100個厚血膜視野和200個薄血膜視野，未發(fā)現(xiàn)瘧原蟲，方可出示陰性報告。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等技術(shù)進一步提高了檢測瘧原蟲的靈敏度和特異性，并可同時檢測4種瘧原蟲蟲種[4- 5]。

本組病例1和4為感染間日瘧原蟲患者，紅細胞感染間日瘧原蟲后幾乎均會腫脹，且紅細胞上常見薛氏小點；滋養(yǎng)體形態(tài)各異，蟲體顯得極為活躍，環(huán)狀體占被感染紅細胞的1/3；配子體占滿整個紅細胞，核大而疏松，瘧色素多而分散；成熟裂殖體充滿紅細胞，通常為10～24個裂殖子且排列不規(guī)則，瘧色素集中[6]。

病例2、3和5為惡性瘧原蟲感染患者，惡性瘧原蟲感染紅細胞通常不會腫脹，環(huán)狀體占被感染紅細胞的1/5，外周血涂片中罕見惡性瘧原蟲未成熟裂殖體，未成熟裂殖體核小而致密并開始分裂，瘧色素集中于中央，未成熟的配子體核已不似環(huán)狀體時緊密而顯得較為疏松，棕黑色瘧色素顆粒多分布于核周[6]。其中病例5首先采用手工計數(shù)法進行復(fù)檢，未能通過鏡檢找到血小板減少的原因；血涂片復(fù)檢后，在血液標本中找到大量惡性瘧原蟲環(huán)狀體。血小板稀釋液充入計數(shù)板的惡性瘧原蟲極易與血小板混淆，提示在血小板減少時，選擇血涂片復(fù)檢更易發(fā)現(xiàn)瘧原蟲。

瘧原蟲感染患者在做全血細胞分析時，白細胞散點圖表現(xiàn)不一。瘧原蟲代謝產(chǎn)物瘧色素在瘧原蟲裂殖體成熟后，從紅細胞中釋放出來，繼而被宿主中性粒細胞所吞噬。吞噬了瘧色素的中性粒細胞的側(cè)向角散射光強度發(fā)生改變，在以側(cè)向角散射光強度和側(cè)向熒光強度進行白細胞分類為原理的Sysmex XE- 5000全自動血細胞分析儀上，患者嗜酸性粒細胞與中性分葉核粒細胞兩群細胞不能完全分開(圖5)，不同于嗜酸性粒細胞增多癥患者的白細胞散點圖，這與文獻報告結(jié)果[7]完全一致。

圖 5 瘧原蟲和嗜酸性粒細胞散點圖A.瘧原蟲分布位置(箭頭)；B.嗜酸性粒細胞分布位置(箭頭)

綜上，本組5例患者均在做血常規(guī)檢測時，因血小板減少觸發(fā)血常規(guī)復(fù)檢規(guī)則進行血涂片復(fù)檢而發(fā)現(xiàn)瘧原蟲感染。白細胞正常或減低，部分患者外周血可見幼稚粒細胞；有些患者在病情發(fā)展至一定時期時，還會因瘧原蟲破壞紅細胞而出現(xiàn)貧血。血小板減少是瘧疾患者血常規(guī)檢查的常見變化，因此血涂片復(fù)檢對發(fā)熱待查患者尤為重要。在進行血常規(guī)復(fù)檢時，一旦懷疑血液內(nèi)可能存在寄生蟲，要結(jié)合臨床診斷和必要的臨床表現(xiàn)，提高對血液寄生蟲的檢出率，減少誤診和漏診概率。

[1]Cui W, Wu W, Wang X, et al. Development of the personalized criteria for microscopic review following four different series of hematology analyzer in a Chinese large scale hospital [J]. Chin Med J, 2010,123:3231- 3237.

[2]北京協(xié)和醫(yī)院血細胞分析復(fù)檢規(guī)則制定組. Siemens Advia 2120血細胞分析儀復(fù)檢規(guī)則的制定及應(yīng)用[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2010,3:674- 679.

[3]紀愛萍,甘紹伯,馮曼玲, 等. 瘧疾伴發(fā)血小板減少的臨床觀察[J]. 中國人獸共患病雜志,2000,16:118.

[4]汪圣強,周華云,李宗劉, 等. SYBR GreenⅠ染料法定量PCR用于人體瘧原蟲定量檢測及蟲種鑒別的研究[J]. 中國血吸蟲病防治雜志,2011,23:677- 681.

[5]易海華,祝長青,孫慧宇, 等. 應(yīng)用LAMP技術(shù)對4種瘧原蟲進行屬種鑒定的初步研究[J]. 中國媒介生物學(xué)及控制雜志,2011,22:355- 358.

[6]吳觀陵.人體寄生蟲學(xué)[M]. 3版. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2005.

[7]戴燕,潘志文，張志英, 等. XE- 2100血細胞分析儀嗜酸粒細胞異常散點圖報警篩選瘧原蟲感染的研究[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2008,31:763- 766.

崔 巍 電話：010-69159713，E-mail：cuiw@pumch.cn

R382.9；R446.11+1

A

1674-9081(2014)03-0327-04

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.03.016

2014- 05- 04)