WY14643對高血壓大鼠血管內皮的保護作用

唐 亮，李 健，屈 晨，周月宏，張 曼

WY14643對高血壓大鼠血管內皮的保護作用

唐 亮1，李 健1，屈 晨1，周月宏2，張 曼1

目的 觀察WY14643對高血壓大鼠血管內皮的作用機制。方法 通過將38-42周的自發性高血壓大鼠SHR分離獲取主動脈，水浴在10 ml的組織浴槽中。隨機分為2組，SHR組9只使用蒸餾水處理作為對照，WY14643組10只使用WY14643進行干預，搜集浴槽中的液體，檢測血管舒張因子的變化，檢測血管組織中內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的改變。結果 經過WY14643處理后，與SHR組相比，WY14643組 NO( 23.4±3.2) μmol/L和PGI2(前列環素)(413.5±113.6)ng/L的含量明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論 WY14643對高血壓大鼠血管內皮具有保護作用。

高血壓大鼠SHR；血管舒張因子；一氧化氮合成酶；前列環素;內皮素

近年來，隨著社會環境、人口老齡化及生活習慣的改變，高血壓病的發生率越來越高，繼而導致各種心腦血管疾病的發生呈增高趨勢[1]。研究表明，內皮細胞在高血壓病的發生中具有重要作用，血管內皮細胞通過釋放血管內皮素，保持其平衡來調節血管的收縮節律。高血壓、糖尿病等病理狀態下，內皮細胞損傷，使得舒縮因子的平衡被打破，從而導致冠心病等疾病的發生。Van Bilsen[2]提出衰竭心肌代謝重構(metabolic remodeling)的概念后,心肌細胞糖脂利用和能量代謝紊亂被認為參與了冠心病的發生，過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)在其中的作用越來越多的被揭示，其廣泛的分布于血管內皮及心肌細胞中，PPAR表達下降可能是心肌底物和能量代謝紊亂的基礎，有可能是冠心病發病的機制[3]。Wy14643是過氧化物酶體增殖物激活受體雙重激動藥，它可能對于內皮功能具有保護作用。本研究使用SHR觀察Wy14643對血管舒張因子和收縮因子的影響，進一步探討其對高血壓發生過程中內皮功能障礙改善機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 38～42 周的雄性SHR大鼠19只，體重340～380 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，清潔條件下喂食標準飼料，自由飲水，飼養于12 h/12 h明暗交替的環境中，溫度(21±1)℃。

1.2 試劑 Wy14643(CAS 50892-23-4| 圣克魯斯生物技術公司)，PGI2 ELISA試劑盒(上?？泼羯锟萍加邢薰?BH4617),EDHFELISA試劑盒(上海藍基生物科技有限公司，批號E02E0131), ET-1ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，貨號：42101)， AngⅡELISA試劑盒(上海武昊經貿有限公司，貨號：E90005Ra )，NOS羊多克隆抗體(RSm-2118M，Sigma公司)。

1.3 實驗動物分組及主動脈分離 SHR大鼠隨機分為SHR組(9只)和Wy14643組(10只)，通過腹腔注射10%的水合氯醛進行麻醉，0.25 ml/100 g，阻斷血流或離斷血管后10 min內將目標血管獲得，立即保存在4℃克-林二氏重碳酸鹽緩沖液(pH 7.4)中，NaCl(118 mM),KCl(4.7 mM),MgSO4(2.5 mM),KH2PO4(1.2 mM),CaCl2(2.5 mM),NaHCO3(25 mM) ,葡萄糖(11.1 mM))，加入苯腎上腺素 (1 mM)，刺激血管收縮， Wy14643組使用0.1 nM的Wy14643進行處理，處理時間為20 min，SHR組大鼠使用蒸餾水處理作為對照。

1.4 NO含量測定 用LS55熒光分光光度儀測定已知濃度的N-乙酰半胱氨酸-亞硝基硫醇標準溶液在334/453 nm的熒光強度,制定標準曲線。測定反應體系中加入血管蛋白勻漿前后的熒光強度改變從而計算NO含量。

1.5 ELISA檢測PGI2 嚴格按照各種因子的ELISA試劑盒的說明書進行 操作，具體簡述如下：設1孔為空白對照孔( 加100 μl 的蒸餾水)， 設立標準孔8孔，將標準品梯度稀釋(0、50、10、25、50、100 μmol/L)各100 μl按照次序分別加入空白微孔中(設立復孔) ，于空白微孔中依次加入各組樣品血漿100 μl;每孔中加入第一抗體工作液50 μl，充分混勻后將反應板密封，室溫置于搖床 3 h，用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，每孔加酶標抗體工作液(Anti-Rabbit IgG)100 μl，充分混勻將反應板密封，置于室溫1 h，用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，每孔中加入底物工作液100 μl, 置于37 ℃暗處反應30 min，每孔中加入50 μl終止液混勻，用酶標儀在450 nm處測吸光值，制作標準曲線，并計算數值[4]。

1.6 Westernblor檢測eNOS的表達 取-70 ℃ 保存的血管組織 50 mg 采用RIPA裂解液(碧云天生物公司)提取總蛋白，取樣品10 μl采用考馬斯亮藍法測定總蛋白濃度，取40 μg總蛋白上樣，經12%的分離膠電泳分離蛋白，半干轉印至PVDF膜上， 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗膜后分別與抗NOX抗體(1∶600，Sigma )和抗β -actin 的抗體(1∶1000 ，Sigma ) 4 ℃ 雜交過夜，然后與辣根過氧化物酶標記的對應二抗室溫雜交2 h， ECL化學發光系統檢測反應產物信號。 每個標本重復3次，以β -actin為內參進行相對定量分析。

2 結 果

2.1 WY14643對高血壓大鼠NO和PGI2的影響 SHR組NO 含量(5.4±1.6) μmol/L, PGI2含量(27.3±5.6) ng/L。 WY14643組經過WY14643處理后， NO含量(23.4±3.2)μmol/L、 PGI2含量(413.5±113.6)ng/L。與SHR組相比明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.01)。

2.2 WY14643對高血壓大鼠eNOS的影響 取-70 ℃保存的血管組織，用Westrnblot檢測兩組血管組織中eNOS的表達，Westrnblot結果顯示WY14643組血管中eNOS(內皮型一氧化氮合酶)的蛋白表達明顯高于SHR組(P<0.05，圖1)。

圖1 WY14643組大鼠的血管中eNOS明顯升高

3 討 論

自從提出衰竭心肌代謝重構的概念后，越來越多的證據支持心肌細胞糖脂利用和能量代謝紊亂導致心肌重構，最終導致充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)的發生和發展。近年來，學者們逐漸認識到代謝性核受體，尤其是PPAR是正常生理代謝和慢性代謝性疾病發病機制的關鍵環節。代謝性核受體是心肌代謝的節點，在心肌代謝中尤為重要的是PPAR。許多糖脂代謝酶蛋白均是PPAR的靶基因。CHF患者心肌PPAR表達下降可能是心肌底物和能量代謝紊亂的基礎。PPAR廣泛存在于血管內皮及心肌細胞中[1]。

CHF患者心肌組織PPAR亞型α的表達較正常供體心臟組織下降54%。由此推斷PPAR α受損可能參與CHF的發生發展,目前菲諾貝特已作為PPAR 亞型α激動藥被廣泛臨床應用。冠心病、高血壓及慢性心功能不全患者體內交感的激活早已成為定論，血和組織兒茶酚胺水平增加將導致脂肪細胞中三酰甘油分解增加，使得血游離脂肪酸水平增加，成為導致心肌胰島素抵抗的主要機制。過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑亞型γ已被廣泛應用作為胰島素增敏劑，增加細胞對胰島素的利用。

PPAR亞型α和亞型γ的雙重激動藥WY14643是通過干預血管內皮收縮因子的釋放來調節內皮的損傷與修復[5]。在高血壓狀態下，大鼠的血管內皮釋放出的血管收縮因子，使得疾病進一步加重，導致了一個惡性的循環模式[6]。血脂及血糖的異?？梢砸饎用}粥樣硬化斑塊形成已被臨床證實，但PPAR雙重激動藥Wy14643除調整血糖及血脂外對高血壓的干預的相關機制還不明確。血管內皮收縮因子的產生是通過環氧化酶介導的[7]。本研究結果顯示，經過WY14643處理后的SHR大鼠血管，NO和PGI2的含量明顯升高，在生理情況下血管內皮細胞可產生血管內皮素，如血管收縮因子和舒張因子并保持其平衡，從而可以調節血管的收縮與舒張，NO和PGI2經過大量研究證明都是血管舒張因子，可以增強血管的舒張功能。尤其是NO可以通過細胞膜迅速傳遞，并可以達到血管平滑肌細胞，使平滑肌松弛，從而動脈血管擴張，以完成調節血壓和血流分布的作用。也有研究證實，內源性NO不僅有血管舒張功能，還能調節血管內皮的生長[8]，觸發血管活性物質的釋放，促進血管生長與再生，對血管起到保護作用。本研究還發現，大鼠血管eNOS(內皮型一氧化氮合酶)的表達也明顯升高，eNOS的升高，促使NO合成的增加，起到血管舒張及血管保護作用[9]，從而進一步印證了WY14643對血管內皮的保護作用。WY14643通過對過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)亞型α和亞型γ的作用，促使血管內皮產生更多的eNOS，使NO的表達增加，同時也使PGI2的含量明顯升高，它們對血管內皮共同起到保護作用[10]。

綜上所述，應用PPAR雙重激動藥WY14643能改善血管內皮收縮，血管內皮收縮是高血壓的獨立風險因素，減少血管內皮收縮是降低血壓的方式之一，也表明PPAR雙重激動藥WY14643是提高血管內皮功能的有效藥物。

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(2013-10-26收稿 2013-12-20修回)

(責任編輯 郭 青)

Effect of WY14643 on vascular endothelial function in hypertensive rats

TANG Liang1, LI Jian1, QU Chen1, ZHOU Yuehong2, and ZHANG Man1.

1.Department of Cardiology,2. Department of Endocrinology, Central Hospital Attached to Shenyang Medical College, Shenyang 110024,China

Objective To observe the effect of WY14643 on vascular endothelium in rats with hypertension. Methods We selected spontaneous hypertensive rats(SHR) of 38-42 weeks, isolated the aorta and bathed it in 10 ml tissue bath. We randomly divided them into 2 groups: rats of SHR group was just treated with distilled water as control group, 10 rats of WY14643 group was only treated with WY14643 as intervention group.The liquid in bath was collected to detect the changes of vasodilator and eNOS in vascular tissue. Results NO and PGI2(prostacyclin) levels and eNOS(nitric oxide synthase) expression were significantly increased after WY14643 treatment.There was a statistically significant difference (P<0.05) between the two groups. Conclusions WY14643 plays a protective role on vascular endothelium in rats with hypertension.

SHR hypertension rats；vasodilatation factors；nitric oxide synthetase; prostacyclin；endothelin

沈陽醫學院青年基金支持項目(20122029)

唐 亮，碩士，主治醫師，E-mail: hannash@eyou.com

120001,沈陽醫學院附屬中心醫院:1.循環科，2.內分泌科

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