不同區域污水處理廠活性污泥中微生物菌落結構分析

楊倩，蔣陽月，王小軍，陳英文，沈樹寶，石利利，劉濟寧

（1南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京210009；2環境保護部南京環境科學研究所，江蘇 南京210042）

活性污泥法處理廢水是用生物法處理廢水的最主要方法。活性污泥是處理廢水的核心，主要包括各種類型的微生物，如細菌、原生動物、真菌、后生動物、病毒和藻類等，其中細菌約占總微生物種群的95%，并在廢水處理過程中起到關鍵作用[1]。對活性污泥中微生物菌群的研究能夠從微觀上分析活性污泥處理廢水的機理，并且可以有效分析污水處理廠運行過程中出現的諸多問題，如污泥膨脹[2-3]等。因此，活性污泥的微生物群落分析是生物法處理廢水的研究重點。在20 世紀80年代之前主要以傳統的分離培養法為主，如顯微鏡觀察微生物形態、純種分離純化、菌落計數等[4-8]，但是培養基選擇的不同會導致生長微生物的差異，并且環境中的很多細菌很難通過培養而得到[9]，因此嚴重影響對菌群結構的分析。另外有研究表明，活性污泥中只有1%～15%的微生物為可培養微生物[10]，因此傳統培養法只能獲悉活性污泥的部分信息。隨著生物分子學技術的發展，基于16S rRNA 為主要基石的聚合鏈式反應（PCR）技術、克隆文庫技術、熒光原位雜交（FISH）等免培養的分子生物學技術逐步應用于環境微生物的分析中[11-15]。其中聚合鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）法能夠避免傳統微生物分離培養的缺陷，且操作簡單快捷，廣泛應用于環境微生物多樣性檢驗和動態分析中[16-21]。不少研究者用PCR-DGGE 法分析了不同運行工藝或不同處理對象的活性污泥之間的差異性，如Abd 等[22]分析了兩種不同運行工藝的活性污泥的微生物群落組成及動態變化，Nico Boon 等[23]比較了處理不同產業廢水的活性污泥的菌群差異性，但是對于不同區域活性污泥的差異性報道卻很少。

中國地大物博，南北跨度較大，不同區域的自然環境和人文經濟情況也相差巨大。本工作結合純種分離純化和變性梯度凝膠電泳法等手段，對中國從南方至北方不同區域的污水處理廠的活性污泥中的細菌群落特征和多樣性進行分析，揭示其地域差異性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源及試劑

活性污泥樣品分別采集自廣州、南京、沈陽地區的市政污水處理廠的曝氣池末端，各污水處理廠的運行工藝和取樣時間見表1。所有樣品用無菌采樣袋盛裝并放入冰盒內保存運回實驗室，樣品保存在-20℃用于DNA 提取。

細菌的培養用LB（Luria-Bertani）培養基，其成分為：胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，氯化鈉10.0g，瓊脂粉20.0g，蒸餾水1000mL，pH 值7.2。

1.2 測定項目和方法

1.2.1 活性污泥可培養微細菌數量

采用稀釋平板法測定活性污泥中細菌的數量，按照GB 4789.2—1994 《中華人民共和國國家標準食品衛生微生物學檢驗 菌落總數測定》和SN 0168—92《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準 出口食品菌落計數》進行菌落數測定。

表1 各城市污水處理廠基本情況

1.2.2 活性污泥可培養細菌鑒定

在上述LB 培養基上，根據菌落形態、顏色等特征的差異性挑出不同的可培養細菌，每一種菌分別挑取少量，重新在平板培養基上進行三區劃線分離，將平板倒置在37℃培養箱中培養。待菌株長好后，檢查其特征是否一致，同時將細胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物細胞。若有雜菌，須再次進行分離純化，直到獲得純培養，然后采用16S rRNA 基因序列分析技術進行鑒定。16S rDNA 片段的擴增，采用引物27F（5’-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3’）和1492R（5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）。PCR 擴增體系為25μL，2×Master Mix 12.5μL，上下游引物各1μL(10μmol/L)，DNA 模板1μL(15ng)，無菌超純水9.5μL。PCR 擴增程序為：95℃預變性2min，95℃變性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸2min，共29 個循環，72℃延伸10min。PCR 產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送去南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

1.2.3 活性污泥DNA 提取及PCR 擴增和變性梯度凝膠電泳

活性污泥樣品經離心后，沉淀部分使用UltraClean TM Soil DNA Isolation 試劑盒（Mo BIO Laboratories）提取DNA，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

DNA 的PCR 擴增體系均為50μL 體系：10×PCR緩沖液5μL，MgCl23.5μL(20mmol/L)，dNTP 2μL(10mmol/L) ， 上 下 游 引 物 518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’) 和 GC338F(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG CACGGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGC-3’)各1μL(10μmol/L)，Taq DNA 聚合酶（REGEN BIOTEC公司）0.3μL(1.5U)，DNA 模板1μL(15ng)，無菌超純水36μL。PCR 產物用1%的瓊脂糖凝膠檢測。變性梯度凝膠電泳（DGGE）采用CBS-DGGE 電泳系統（CBS Scientific Co.），聚丙烯酰胺凝膠質量分數為8%，變性梯度從35%至65%（100%的變性劑溶液含7mol/L 的尿素和40%甲酰胺）。電泳緩沖液為1×TAE，PCR 產物上樣量為500ng，60℃，100V電泳12h，EB 染色20min，UVP 凝膠影像分析系統拍照[24]。

1.3 數據處理

活性污泥中可培養細菌經測序后，測得的16S rDNA 序列在美國生物技術信息中心（NCBI）核酸數據庫（Genbank）中進行Blast 搜索比對。采用Clustal X、BioEdit 和Mega 4.0 軟件構建系統發育樹。

DGGE 指紋圖譜使用Gelcompar Ⅱ 軟件分析[25]。其中，聚類分析使用UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic averages）方法。

2 結果與討論

2.1 活性污泥的基本參數和細菌總數

所取樣品的污泥沉降比（SV30）、懸浮物濃度（MLSS）、污泥體積指數（SVI）以及細菌總數見表2。除了CD 的SVI 值稍微偏高外，大部分活性污泥的SVI 值均在50～120 之間，表明這些污泥的性能均良好，CD 可能是有輕微的污泥膨脹現象發生。菌落計數的樣品是從曝氣池取得的未經沉淀的活性污泥。廣州和沈陽地區的樣品在采樣后運回實驗室的時間較長，在保存過程中部分細菌的活性喪失，可能是這兩個地區的菌落數與南京地區相差一個數量級的原因。另外污水處理廠的處理工藝和污泥的泥齡可能也會影響細菌數。

表2 活性污泥的基本參數

2.2 可培養細菌的菌種鑒定

根據菌落形態和顏色的差異性，南京地區CD、CB、JXZ、JN 分別分離出10、12、10 和11 種菌；廣州地區DTS、LD 和LR 分別分離出9、11、和8種菌；沈陽地區SSW 和XNH 各得到9 種菌，共89種細菌。將測得的細菌16S rDAN 序列在NCBI 核酸數據庫中進行Blast 比對，獲得各條序列的同源性信息。

比對結果顯示所測的序列與Blast 數據庫中的已知序列均具有較高的相似性，均在96%以上，因此可以確定這些細菌的菌屬[26]。大部分活性污泥中均包含假單胞菌（Pseudomonas）、不動桿菌（Acinetobacter）、芽孢桿菌（Bacillus）、氣單胞菌（Aeromonas）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等，這些都是活性污泥中常見的細菌[27]。

將所測得的目的序列與對應的親緣關系最近的已鑒別出的微生物進行多序列比對后，結合Clustalx和Mega 構建系統發育樹，以顯示所分離出的菌種與已知菌種直接的親緣關系。圖1 是3 個地區分離的可培養細菌的序列與親緣種的系統發育樹。對所構建的系統發育樹進行劃群分析，發現每個污水處理廠的活性污泥中的細菌都主要屬于厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），包括β-變形菌門（Bataproteobacteria）和γ-變形菌門（Gamaproteobacteria），這也跟之前的文獻研究結果相一致[28]。其中，厚壁菌門主要以芽孢桿菌為主，另外含有少量的微桿菌和葡萄球菌。芽孢桿菌產生的蛋白酶和淀粉酶等酶能夠分解污水中的有機大分子，產生的細菌素對某些致病菌具有抑殺作用[29]，另外芽孢桿菌還具有促硝化作用[30]，能夠降解廢水中的氨氮，因此具有較好的污水凈化能力。β-變形菌門所占變形菌門的比例相對較少，主要以奈瑟菌目和伯克氏菌目為主。γ-變形菌門在活性污泥中屬于優勢菌門，活性污泥中常見的假單胞菌、腸桿菌、氣單胞菌等都屬于γ-變形菌門。南京地區還分離出了幾種放線菌（Actinobacteria），包括鏈霉菌（Streptomycetaceae）和微球菌（Micrococcaceae）等，尤其是CD 的活性污泥中分離的放線菌較多，這應該是CD 的SVI 值偏高的主要原因。

圖1 活性污泥中可培養細菌的16S rDNA 系統發育樹

2.3 活性污泥的DGGE 分析

圖2 16S rDNA V3 片段PCR 產物的DGGE 圖譜

從圖2 的DGGE 圖譜中可以看出，不同活性污泥樣品的電泳圖譜在條帶的數量、位置以及亮度上都存在一些差異，如1 號條帶在XNH 中較亮，20 號條帶在DTS 中比較亮，29 號條帶在CD 中較亮，35 號條帶在CB 中較亮，而這些條帶在其他樣品中均比較弱甚至未出現，說明各樣品中具有不同的菌落結構，因為運行工藝、進水水質如BOD、COD 等的差異以及pH 值、溫度、曝氣時間等各種因素的不同均會導致活性污泥的組成變化。但是所有活性污泥樣品中的菌種豐富度都非常高，不同的樣品中存在很多相同的條帶，如條帶4、5、6、7、9、10，說明活性污泥中大部分微生物的種類是比較固定的，是屬于所有活性污泥中共有的優勢菌群，其中6、7 條帶在大部分泳道中都比較亮，說明這兩種菌在活性污泥中的含量很高，在污水處理過程中起到關鍵的作用。

從樣品的相似性矩陣圖（表4）可知，南京地區，城北（CB）和江心洲（JXZ）的相似性最高，達到81.34%，江寧（JN）和江心洲的相似性最低，只有58.35%；廣州地區獵德（LD）和瀝溶（LR）的相似性最高，為85.47%，瀝溶和大坦沙（DTS）的相似性最低，也達到75.77%，沈陽地區沈水灣（SSW）和仙女河（XNH）的相似性較低，只有45.59%，而不同地區樣品間的相似性最高只能達到61.35%，大部分都在50%左右。最終進入污水處理廠的城鎮污水包括居民生活污水、服務業污水、部分預處理工業廢水和初期雨水組成，污水的水質受到人為要素的影響，包括經濟發展、產業結構、居民生活習慣和消費習慣等因素，也會受到自然要素的影響，如區域所在地的氣候和水資源情況等，活性污泥的性質會隨著進水水質的不同而不同，因此相同區域由于各方面因素較相似從而其活性污泥的菌落結構會比較類似，而不同地區的污泥差異性會較大。但是同一地區不同區域內的產業結構的差異性同樣會導致污泥結構的差異。

表3 樣品的相似性矩陣圖

利用聚類分析方法對不同微生物群落進行分析，能夠研究微生物群落之間的相互關系。從細菌的DGGE 指紋圖譜聚類分析（圖2）可以看出，9個樣品聚為3 類：南京地區的CB、JXZ、JN 和CD為一類，廣州地區的LD、LR 和DTS 為一類，沈陽地區的SSW 和XNH 為一類。從總體上看，南京地區與廣州地區又聚為一大類，其相似性大于50%，并且明顯可以看出，同一地區的不同活性污泥中的優勢菌群也比較相似，說明活性污泥的地域性差別非常大，這些可能與各地區的自然環境以及人們的生活習慣有關。結合表1 各污水處理廠的工藝特點還可以看出，活性污泥之間的地域差異性高于工藝的差異性。根據2008年3 月國務院第一次全國污染源普查領導小組辦公室頒發的“第一次全國污染源普查城鎮生活源產排污系數手冊”，結合行政區域和地理環境因素、城市經濟水平、氣候特點和生活習慣等將全國生活污水、生活垃圾的產生和排放系數劃分為不同的區域，其中沈陽屬于一區二類，南京和廣州均屬于二區一類，并且從氣候方面而言，沈陽屬于北溫帶受季風影響的半濕潤大陸性氣候，南京和廣州都屬于亞熱帶季風氣候，因此可以推斷，南京和廣州地區的原水結構比較相似，且與沈陽地區的差異性較大，而原水的性質會影響相應的活性污泥的性質[1]，從而導致了南京和廣州的污泥相似度高于沈陽。

圖3 DGGE 圖譜的聚類分析

3 結 論

運用純種分離培養的方法和DGGE 法研究了中國從南方到北方不同地區的污水處理廠的活性污泥中微生物種群的相似性和差異性。3 個地區共分離出89 種細菌，通過16S rDNA 序列分析對不同活性污泥中分離出的細菌進行鑒定，發現這些細菌主要屬于厚壁菌門（Firmicutes）、β-變形菌門（ Bataproteobacteria ） 和 γ- 變 形 菌 門（Gamaproteobacteria）。DGGE 分析表明活性污泥中的菌種豐富度都非常高，并且不同的樣品間有很多相同的條帶，具有較大的相似性，其中，相同地區樣品間的相似性大于不同地區樣品間的相似性，說明除了污水處理廠本身運行工藝的差別外，不同地區的自然經濟環境、人們生活習慣等因素也會影響活性污泥中微生物的群落結構。

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