卵黃抗體/殼聚糖微囊的制備與體外釋放性能的研究

薛海燕，杜枘宣，韓 芳，宋宏新

（1.陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安 710021;2.陜西恒通果汁集團股份有限公司，陜西西安 710075）

卵黃抗體（IgY）是特定病原菌免疫禽類后，由母雞血清中的免疫球蛋白選擇性地轉移到卵黃，是存在于卵黃中的一種免疫球蛋白［1］。IgY是一種高產量、安全、高療效的生物醫藥制品，口服IgY，無致癌、無毒、無過敏反應、致突變、致畸，且不結合補體和Fc受體［2］。已有針對毒素、細菌、真菌、病毒、寄生蟲等IgY 的研究報道，如牙周致病菌［3］、幽門螺桿菌［4］、輪狀病毒［5］、大腸桿菌［6］、白色念珠菌［7］、血吸蟲［8］等。然而IgY用于胃腸道疾病防治時，由于IgY容易受到胃部環境的影響，而被酸和酶降解，導致治療效果顯著降低［9－10］。王麗英等［11］通過單甲氧基聚乙二醇（mPEG）對IgY進行了化學修飾，提高了它的酸堿穩定性。Kovacs－Nolan J［10］利用甲基丙烯酸共聚物包埋 IgY，Li xiao－yu 等人［12］利用殼聚糖與海藻酸鈉制備IgY微囊，均顯示了良好的活性保護作用。殼聚糖，α（1，4）－2－氨基－2－脫氧 β－D－葡聚糖，是一種無毒，低免疫原性，可生物降解的聚陽離子聚合物，具有pH響應性，是一種新型生物醫學和藥物傳遞應用材料［13］。以殼聚糖為壁材制成的微囊，能夠保護IgY在胃中不被酸和酶降解，而是安全到達小腸，最大限度地發揮免疫治療作用。

本研究采用無溶劑法制備一種IgY/殼聚糖微囊。以殼聚糖為壁材，三聚磷酸鈉（TPP）為交聯劑，離子交聯法在溫和水相中制備IgY－殼聚糖微囊，通過星點設計－效應面法優化制備工藝。并通過納米粒度及Zeta電位分析儀和掃描電鏡對IgY/殼聚糖微囊進行表征，為IgY免疫防治功能開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EHEC O157∶H7（EDL 933） 由中國疾病預防控制中心饋贈;免疫用雞為3個月臨產蛋母雞 購自西安郊區雞場;完全弗氏佐劑與不完全弗氏佐劑 美國Sigma公司;標準雞IgG及HRP酶標兔抗雞Ig G 北京博奧森生物技術有限公司;殼聚糖（分析純，脫乙酰度為92.39%，粘均分子量為600kDa） 日本BETTER公司;三聚磷酸鈉（TPP，分析純） 天津市天力化學試劑有限公司;牛血清白蛋白（BSA，分析純） 北京鼎國生物技術有限公司;其他化學試劑均為分析純級。

磁力加熱攪拌器 國華電器有限公司;HC－3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳儀器有限公司;酶標儀（Wellscan－MK－3）Thermo公司;超濾系統（超濾膜截留分子量5萬）Millipore公司;精密 pH 計 Sartorius;Christ Alpha 1－4/2－4 LD plus型冷凍干燥機 德國Marin Christ公司;UV－2600型紫外－可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;馬爾文納米粒度及Zeta電位分析儀ZS90 英國馬爾文儀器有限公司;S－2700型掃描電鏡 日本日立集團。

1.2 IgY/殼聚糖微囊的制備與表征

1.2.1 卵黃抗體的制備 抗大腸桿菌－IgY的制備方法參考文獻［14］進行。即以煮沸法滅活E.coliO157∶H7制備菌體抗原，與等量完全弗氏佐劑混合后，免疫3只臨產母雞，每只雞2mL，胸肌兩點及翅下兩點注射。每間隔兩周采用不完全弗氏佐劑與抗原等量混合加強免疫，共加強免疫3次。首免后開始收集雞蛋，間接ELISA檢測IgY效價［14］，收集效價達1∶4000以上的卵黃制備IgY，蛋白質含量采用280紫外比色法檢測。分離純化方法參考文獻［15］，采用水稀釋－凍融法獲得水溶性組分（WSF），50kDa超濾膜超濾濃縮5倍后，45%的飽和硫酸銨鹽析沉淀IgY，離心后獲得的沉淀對0.02mol/L PBS透析除鹽，用于后續研究。鹽析IgY經間接ELISA檢測效價為1∶40000，蛋白質含量 24.6mg/mL。

1.2.2 IgY/殼聚糖微囊的制備 將一定量殼聚糖溶于1%乙酸溶液，加入適當濃度IgY后用1mol/L HCl調節pH至5.6，在高速磁力攪拌下，緩慢滴入TPP溶液，待觀察到體系呈現乳光時，停止攪拌，將混懸液高速離心（10000×g，4℃，45min），用紫外分光光度法測定上清液中IgY的蛋白質濃度。離心得到的沉淀，即微囊，冷凍干燥，稱量。按照下式分別計算微囊對IgY的包封率和載藥量。間接ELISA檢測反應后及溶出后IgY活性，計算活性保留率。

1.2.3 星點設計－效應面法優化IgY/殼聚糖微囊制備工藝 根據已有研究文獻的初步實驗研究［16－17］，確定殼聚糖溶液的質量濃度、殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比、IgY的質量濃度作為影響IgY－殼聚糖微囊包封率和載藥量的主要因素，以殼聚糖溶液的質量濃度（X1）、殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比（X2）、IgY的質量濃度（X3）作為考察對象，以殼聚糖微囊對IgY的包封率（Y1）和載藥量（Y2）為響應值，采用Design－Expert 8.0.5統計分析軟件的效應面法安排實驗，星點設計的因素及水平見表1。

表1 星點設計的因素與水平Table 1 Factors and levels in the central composite design

1.2.4 IgY/殼聚糖微囊的表征 10mL以最佳方法制備的IgY－殼聚糖微囊混懸液，pH調至6.5，經超聲分散6min后，通過馬爾文納米粒度儀及Zeta電位分析儀表征其平均粒徑、分散度及表面電位［18］。微囊混懸液于光學顯微鏡下觀察外觀，經24h冷凍干燥后的IgY微囊真空噴金后，采用掃描電鏡（SEM）觀察其表面形態。

1.3 IgY/殼聚糖微囊的體外釋放性能

精確稱取100mg經冷凍干燥的IgY－殼聚糖微囊及25mg凍干IgY，以模擬胃液（SGF）及磷酸鹽緩沖液20mL為溶出介質，于37℃，100r/min進行釋放度實驗。分別于 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0h 各取樣2mL，同時補足同體積等溫溶出液，樣品液過濾后測定IgY蛋白質濃度，間接ELISA法測定樣品的吸光度值OD450，計算活性保留率及累積釋放率，重復實驗三次。以時間為橫軸、累積釋放率為縱軸繪制釋放曲線［19］。

2 結果與分析

2.1 星點設計－效應面法優化IgY/殼聚糖微囊的制備工藝

2.1.1 星點設計的實驗結果分析 星點設計優化微囊制備條件實驗結果見表2。

表2 星點設計及結果Table 2 Central composite design arrangement and experimental results

采用Design－Expert 8.0.5統計分析軟件對表2數據進行擬合回歸，得到效應面的回歸方程:

殼聚糖微囊對IgY的包封率（Y1）和載藥量（Y2）的數學擬合模型的相關系數分別為0.7960和0.7334，說明通過多元二次回歸得到的Y1和Y2的模型與實驗擬合較好，具有較高的可靠性。當p值小于0.05時，即表示該項指標顯著。根據Y1和Y2模型的方差分析結果（表3），推測出殼聚糖微囊對IgY的包封率和載藥量建立的回歸數學模型顯著（p＜0.05）。

模型的方差分析（表3）結果表明，殼聚糖微囊對IgY的包封率（Y1）和載藥量（Y2）模型，根據3個因素的F值大小可以推斷，在所選擇的實驗條件下，3個因素影響Y1和Y2的主效應順序均為:殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比（X2）＞IgY的質量濃度（X3）＞殼聚糖溶液的質量濃度（X1）。

2.1.2 效應面分析 根據回歸方程，應用Design－Expert 8.0.5軟件分別繪制Y1和Y2與自變量的效應面圖（其他2個自變量設為中心點值），結果見圖1。圖1A表明，在殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比較小和IgY的質量濃度適中時，微囊的包封率較高。在所選范圍內，微囊的包封率存在最大值。圖1B表明，在殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比較小和IgY的質量濃度較高時，微囊的載藥量較高，在所選操作范圍內，微囊的載藥量存在最大值。

表3 殼聚糖微囊對IgY的包封率和載藥量的模型方差分析Table 3 ANOVA for the entrapment efficiency and the loading efficiency for IgY of chitosan microencapsulation

圖1 殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比和IgY的質量濃度對包封率Y1（A）及載藥量Y2（B）影響的效應面圖Fig.1 Three－dimensional response surface diagram（B）showing the chitosan/TPP（w/w）and IgY（mg/mL）on Y1and Y2

應用Design－Expert 8.0.5軟件優化程序，得出制備IgY－殼聚糖微囊的最佳制備工藝參數:殼聚糖溶液的質量濃度0.23g/100mL，殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比3.93∶1，IgY的質量濃度2.46mg/mL。在此制備工藝條件下，殼聚糖微囊對IgY的包封率和載藥量的預測值較高，分別可以達到95.79%和27.84%。

考慮實際操作便利，最佳工藝修正為殼聚糖溶液的質量濃度0.23g/100mL，殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比4∶1（預測為3.93∶1），IgY 的質量濃度 2.46mg/mL，制備IgY－殼聚糖微囊。測定微囊的包封率和載藥量，以驗證響應面法的可行性。結果顯示包封率的實測值93.26%，載藥量的實測值25.64%。實測值與未調整的預測值偏差較小，說明所得到的優化區域符合設計目標，實驗設計和數學模型具有可靠性和重現性。可見效應面法得到的制備條件較為可靠，具有使用價值。采用ELISA檢測微囊制備后上清中游離IgY及在PBS中釋放8h的IgY的活性保留率，分別為96.3%和94.0%，表明在制備過程中IgY活性受到影響較小。

2.2 IgY/殼聚糖微囊的表征

采用納米粒度及Zeta電位分析儀檢測在最佳條件下制備的IgY/殼聚糖微囊懸浮液，如圖2A，測得微囊平均粒徑為2.16μm，PDI為0.312，小于0.5，說明微囊分散均勻。測得空白微囊的Zeta電位為37.86mV，IgY/殼聚糖微囊的 Zeta電位為26.20mV（如圖2B），表面電位明顯降低，IgY在大于等電點的溶液中帶負電荷，隨著IgY通過離子作用與殼聚糖微囊結合，使微囊表面電荷趨于中性化，即表現為Zeta電位降低，實驗結果表明，IgY－殼聚糖微囊的表面與IgY結合。

圖2 IgY－殼聚糖微囊的粒徑及Zeta電位分布圖Fig.2 Particle size and Zeta potential distribution of IgY－chitosan microencapsulation

采用優化后的方法制得IgY/殼聚糖微囊顯微照片如圖3A所示，分散性較好。IgY/殼聚糖微囊經冷凍干燥后進行SEM，如圖3B，微囊出現大量聚集，但依稀可看到大量氣孔。這是由于殼聚糖的分子鏈上含有大量的游離氨基，易與三聚磷酸鈉發生交聯反應，冷凍干燥后水分子升華，形成網狀結構［19－20］。而且由于IgY帶有負電荷，冷凍干燥后，離子周圍水化層消失，還會導致微囊聚集度增加。

圖3 IgY/殼聚糖微囊的顯微照片及SEM圖Fig.3 Scanning electron microscopy（SEM）of IgY－chitosan microencapsulation

2.3 IgY/殼聚糖微囊的體外釋放性能

IgY/殼聚糖微囊的持續釋放性能如圖4所示。IgY/殼聚糖微囊在SGF中，30min的累積釋放率只有12.2%，在1h時累積釋放率達到61.3%，在2h及以后時達到85%以上。在PBS緩沖液中，在30min時累積釋放率只有6.1%，在1h時只有22.6%，在2h時達到54.6%，在4h時達到86.0%。凍干IgY在30min內，在SGF和PBS中基本完全釋放，而且在SGF中，15min后IgY由于分解所測得的含量還有所下降，因此經微囊化后對IgY釋放具有明顯的緩釋作用，而且避免了胃液的分解帶來的活性損失。同時檢測SGF溶液中IgY的含量，計算活性保留率。對未經包埋的IgY，其活性保留率在1.5h時迅速降至10.4%，而IgY/殼聚糖微囊在SGF中釋放1.5h時，其活性保留率為 85.2%，釋放 6h后，其活性保留率仍然在79.5%。

圖4 IgY/殼聚糖微囊的體外釋放曲線Fig.4 Release curve in vitro of IgY/chitosan microencapsulation

Li Xiaoyu等［12］將IgY經過殼聚糖－海藻酸鈉包埋后，載藥量為25%（w/w），包封率73.93%，經胃腸平均活性保留率在40%～70%之間，SGF中釋放2h的活性保留率最高為74%。本研究采用單一殼聚糖制備微囊，通過響應面法優化制備工藝后，載藥量也達到25%以上，而包封率達到93%，IgY活性保留維持在80%以上，有效地提高了IgY的制備利用效率和生物利用效率。制備操作方法簡單可行，不影響活性。

3 結論

本研究通過星點設計－效應面法確定了IgY/殼聚糖微囊最佳制備工藝條件為，殼聚糖溶液的質量濃度0.23g/100mL、殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比4∶1，IgY 的質量濃度 2.46mg/mL，制得微囊的包封率為93.26%，載藥量為25.64%。微囊平均粒徑為2.16μm，Zeta電位為26.20mV，顯微照片顯示微囊的分散度較好。該微囊在模擬胃液及PBS中均具有較好的緩釋性能，且通過微囊化能保護IgY，減少活性損失。進一步還應探討如何提高載藥量的問題，本研究為胃腸給予IgY的研究開發奠定了基礎。

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