云南牛肝菌的內生真菌分離、鑒定和ITS序列特征研究

岳萬松，熊 勇，2，陳毅堅，2，*

（1.云南民族大學化學與生物技術學院，云南昆明 650500;2.國家民委—教育部共建民族藥資源化學重點實驗室，云南昆明 650500）

牛肝菌科（Boletaceae）是擔子菌亞門傘菌目的重要一科。云南是野生食用菌的王國，目前已知牛肝菌有224種，食用菌144種，分別占全國總數的62%和72%。牛肝菌含有多糖、生物堿、甾醇類化合物、酸類化合物等活性物質，可用于治療腰腿疼痛、手足麻木、四肢抽搐等疾病，還具有抗流感病毒、防治感冒的作用［1］。在云南產量多、味道鮮美、又具經濟價值的有4種:小美牛肝菌（地方名見手青）［Boletus speciosus Frost］、銅色牛肝菌（地方名黑牛肝）［Boletus aereus］、黃皮疣柄牛肝菌（地方名黃牛肝、黃癩頭）［Leccinum crocipodium］、美味牛肝菌（地方名白牛肝）［Boletus edulis］［2］。至今，牛肝菌除個別種據報道在實驗室條件下栽培成功［3－6］，絕大多數種類尚不能通過人工栽培形成子實體［7－8］。目前有關野生食用牛肝菌的研究主要集中在其營養成分分析［9－10］和化學成分分析［11－12］，此外，多篇文獻［13－15］對牛肝菌活性物質多糖的免疫、抗腫瘤及抗氧化作用進行了研究分析。

內生真菌定殖于健康的生物組織內，種類繁多，分布廣泛［16］。近年來，內生真菌的代謝產物的研究倍受關注，大量具有抗菌、抗癌、殺蟲等活性的次生代謝產物從內生真菌中分離出來［17－19］，內生真菌已經成為開發活性物質資源庫。目前國內外對大型真菌的內生真菌方面的研究甚少，仍需進一步研究。本文以產自云南的牛肝菌不同種為材料，分離、純化其內生真菌并進行形態特征研究，再結合rDNA ITS序列分析進行分子鑒定，確定內生菌株的種屬歸類，旨在為牛肝菌內生真菌資源的開發利用提供研究基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肝菌 實驗用新鮮牛肝菌子實體小美牛肝菌（地方名見手青）、銅色牛肝菌（地方名黑牛肝）、黃皮疣柄牛肝菌（地方名黃牛肝、黃癩頭）、美味牛肝菌（地方名白牛肝），均于2013年8～9月分別購自云南省玉溪市和曲靖市集貿市場，新鮮子實體用保鮮袋包裝帶回實驗室，24h內完成內生真菌的分離;引物ITS4、ITS5和 DNA MarKer 北京博邁德生物;2×Power Taq PCR MasterMix 北京百泰克;分離培養基 配制根據參考文獻［20］完成;固體培養基Ⅱ KH2PO40.5g，MgSO40.25g，酒石酸銨 1g，麥芽糖 0.25g，維生素B1 0.5mL（40μg/L），葡萄糖 10g，瓊脂粉 10g，蒸餾水500mL（pH6.0），121℃，滅菌 20min 后備用;液體培養基Ⅱ 配方同上，勿加瓊脂粉。

Eppedorf 5331 PCR儀 德國;GENE GENIUS凝膠成像系統 美國;DYY－GB電泳儀、DYCP－31DN電泳槽 北京六一。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛肝菌內生真菌的分離純化培養 取新鮮的牛肝菌子實體，自來水沖洗數次，去除表面雜質，無菌水沖洗3遍，75%乙醇漂洗3min，再用無菌水沖洗3～5次。用無菌解剖刀將牛肝菌子實體的表皮去掉，將內部的組織切割成0.5cm左右的小塊，接種于培養基中，28℃恒溫培養5～7d。待組織小塊周圍有內生真菌長出后，挑取少許菌絲培養物，純化培養后，部分轉接至固體培養基Ⅱ斜面上保存備用;另一部分轉接至液體培養基Ⅱ里（培養條件為:150r/min，28℃恒溫培養3～4d），每12h觀察菌種生長情況，最后用無菌濾紙過濾得到菌絲體，存于－70℃冰箱里待用。

1.2.2 牛肝菌內生真菌菌落特征和顯微特征觀察 將分離純化得到的牛肝菌內生真菌菌株于培養基Ⅱ平板上三點種植和插片培養5～7d，菌落長出后用于觀察，插片置于顯微鏡下觀察顯微形態特征，對菌株進行初步鑒定。

1.2.3 牛肝菌內生真菌分子鑒定

1.2.3.1 DNA提取 將分離的牛肝菌內生真菌液體培養獲得的菌絲體用于提取DNA，總DNA提取方法參照 CTAB－SDS 法［21－22］并加以改良，用瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA質量。

1.2.3.2 PCR 擴 增、測 序 ITS 通 用 引 物 （ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC;ITS5:GGAAGTAAAA GTCGTA－ACAAGG）［23］，50μL 反應體系包括:25μL 2 ×Power Taq PCR Mixture，引物各2μL，5μL DNA 模板，16μL ddH2O;反應條件:預變性 94℃ 5min，94℃30s，52℃ 30s，72℃ 30s，35 次循環，72℃ 10min，4℃保存。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用Bio－Rad凝膠成像系統觀察結果。

1.2.3.3 PCR 產物的純化、測序及系統發育樹的構建PCR產物用多功能DNA純化回收試劑盒回收，送昆明碩陽科技有限公司測序。測序結果DNAMAN進行拼接，MEGA 5.13分析相關數據，構建發育樹，同時將得到的序列提交GenBank數據庫，并通過在線Blast工具從NCBI下載GenBank等數據庫內已知同源序列多條作為參考序列，用 MEGA 5.13中的Kimura－2－parameter（K2P）模型，鄰接（neighborjoining method，N－J）法構建聚類圖。并應用 DNA STAR和RNAVIZ2.0預測其二級結構。

2 結果與分析

2.1 牛肝菌內生真菌的形態特征

從4種新鮮牛肝菌子實體內部組織塊中分離培養獲得5株內生真菌純菌株，編號為YX1－6、YX1－7、QJ3－6、QJ3－7、QJ3－8，5 株內生真菌的菌落特征和顯微特征見圖1，特征描述記錄和初步鑒定結果見表1（鑒定結果參考中國科學院微生物研究所編寫的《常見與常用真菌》完成［24］）

圖1 牛肝菌內生真菌 YX1－6、YX1－7、QJ3－6、QJ3－7、QJ3－8在培養基Ⅱ上的生長特征Fig.1 Morphology and hyphal structure of YX1－6，YX1－7，QJ3－6，QJ3－7 and QJ3－8 isolated from boletus

2.2 不同牛肝菌內生真菌菌株ITS序列PCR擴增結果

分離獲得的牛肝菌5株內生真菌的PCR擴增結果見圖2。

從圖2可見，5株菌序列長度約在430～630bp之間，PCR產物均出現比Marker清晰明顯的條帶，說明實驗所提的DNA質量較好。

2.3 牛肝菌內生真菌rDNA ITS序列NJ樹構建及分析

分離到的內生真菌分成5組:YX1－6、YX1－7、QJ3－6、QJ3－7和 QJ3－8 分別各為 1 組，做序列相似性比對并構建系統發育樹以NCBI中的ITS序列為聚類外群，采用N－J法對不同牛肝菌內生真菌進行分析并構建遺傳關系樹，自舉檢測1000次。所構建的系統樹見（圖3）。

表1 牛肝菌內生真菌特征記錄和初步鑒定結果Table 1 The preliminary identification results endophytic fungi from boletus

圖2 5株牛肝菌內生真菌菌株ITS－PCR擴增電泳圖Fig.2 Amplification profile of electrophoretogram ITS－PCR of 5 strains of boletus endophyte

通過在線BLAST工具從NCBI數據庫內下載已知的多條相似序列作為參考序列，比較它們的相似性，并用 MEGA 5.13 中的 Kimura－2－parameter（K2P）模型，鄰接（neighbor－joining method，N－J）法構建發育樹（見圖3），NJ發育樹分析結果表明:YX1－6與NCBI數據庫里的多株Trametes hirsuta形成自檢支持率為99%的一個分支，它們親緣關系較近，且BLAST比對結果顯示:YX1－6與Trametes hirsuta相似性都很高，為99%，鑒定為毛栓菌（Trametes hirsuta）。NJ發育樹分析結果表明:YX1－7與NCBI庫里的多株Chaetomium aureum形成自檢支持率為99%的一個大分支，二者親緣關系很近，且BLAST比對結果顯示:YX1－7與多株Chaetomium aureum相似性較高，為99%，鑒定為金色毛殼菌（Chaetomium aureum）。NJ發育樹分析結果表明:QJ3－6菌株與Candida sp（DQ104728）、Candida sp（KF057545）、Candida sp（KF057544）等假絲酵母屬菌株形成自檢支持率為100%的一個分支，它們的親緣關系較近，且BLAST比對結果顯示:QJ3－6菌株與多株Candida sp相似性高達99%，鑒定為假絲酵母屬真菌（Candida sp）。NJ發育樹分析結果表明:QJ3－7菌株與多株Mortierella sp形成自檢支持率為100%的一個分支，親緣關系較近，且 BLAST比對結果顯示:QJ3－7菌株與Mortierella sp（KC180749）相似性高達100%，鑒定為被孢霉屬菌株。NJ發育樹分析結果表明:菌株QJ3－8與Eurotium amstelodami多株菌株形成自檢支持率為96%的一個分支，親緣關系較近，且BLAST比對結果顯示:QJ3－8與Eurotium amstelodami（AF455470）、Eurotium amstelodami（HQ728257）和Eurotium rubrum（AF455528）等多株散囊菌屬菌株的的相似性都高達100%，鑒定為散囊屬真菌。

2.4 牛肝菌內生真菌及其NCBI數據庫相似種ITS rRNA二級結構比較

利用DNA STAR和RNAVIZ2.0預測并比較牛肝菌內生真菌及其NCBI數據庫相似種的二級結構，牛肝菌內生真菌及其NCBI數據庫相似種編號分別為YX1－6和Trametes hirsuta（JN048768、YX1－7和Chaetomium aureum（HQ607894）、QJ3－6 和Candidasp（DQ104728）、Mortierellasp（FJ810149）、Eurotium amstelodami（HQ728257），5株牛肝菌內生真菌及其NCBI數據庫相似種ITS rRNA二級結構異同點見表2。

圖3 根據rDNA ITS基因序列構建的牛肝菌內生真菌與參考類群間的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of boletus endophyte based on rDNA ITS and reference taxa

表2 牛肝菌內生真菌及其NCBI數據庫相似種ITS rRNA二級結構比較Table 2 Contrast and analysis of ITS ribosomal RNA secondary structure ofboletus endophyte and their similar species in NCBI database

3 結論和討論

本文的實驗研究，從云南牛肝菌4個種的新鮮子實體中分得5株內生真菌，用經典分類方法和分子生物學方法鑒定為:YX1－6為毛栓菌（Trametes hirsuta），YX1－7為金色毛殼菌（Chaetomium aureum），QJ3－6 為假絲酵母屬真菌（Candidasp.），QJ3－7 為被孢霉屬真菌（Mortierellasp.），QJ3－8 為散囊菌屬真菌（Eurotiumsp.），從分類結果可見不同種的牛肝菌的內生真菌也不同，顯示了內生真菌的多樣性特征。

進一步用DNA STAR和RNAVIZ2.0分析軟件預測了它們的二級結構，用于分析研究其分類地位。分析結果顯示各分離菌株及其相似種的ITS序列二級結構均為一個中心環及多個螺旋區構成，每個螺旋上又有或多或少的大小不一的莖、環結構，說明牛肝菌內生真菌既具有結構上的共性，又具有鮮明的個性差異。

真菌種類繁多，形態復雜，因此需要采用形態、結構、生理生化等表型方面的特征和各種分子生物學手段進行分類鑒定。該論文對牛肝菌內生真菌的分類鑒定，在形態結構和分子水平上都進行了研究，所得結果一致并可相互印證，可見對內生真菌分類研究，采用綜合性手段的必要性和可靠性。

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