液相芯片檢測高濕環(huán)境對大鼠T淋巴細(xì)胞因子表達(dá)的影響

宋富強(qiáng)，郭文瓊，李 昆，楊 蕓，郭 鑫，李 薇，呼永河

·論著·

液相芯片檢測高濕環(huán)境對大鼠T淋巴細(xì)胞因子表達(dá)的影響

宋富強(qiáng)，郭文瓊，李 昆，楊 蕓，郭 鑫，李 薇，呼永河

目的 液相芯片技術(shù)檢測大鼠血清中細(xì)胞因子的表達(dá)，探討高濕環(huán)境對大鼠細(xì)胞因子的影響。方法 32只SD大鼠隨機(jī)分為兩組，高濕組與正常組，每組16只大鼠。采用人工氣候箱模擬高濕環(huán)境，條件設(shè)置為溫度25 ℃、相對濕度90%～95%。高濕組大鼠每天置于箱中10 h，其余時(shí)間與正常組一樣飼養(yǎng)于常溫常濕的清潔環(huán)境(溫度25 ℃，相對濕度45%～50%)，連續(xù)20 d。動物模型制作完成后，取大鼠腹主動脈血，分離血清，應(yīng)用Luminex200檢測9種細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，高濕組IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10血清水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，IFNγ明顯下降(P<0.01)，TNFα、EGF、VEGF血清水平變化不明顯(P>0.05)。結(jié)論 高濕可引起大鼠血清細(xì)胞因子的改變，Th1/Th2類細(xì)胞因子平衡被打破，使大鼠的免疫自穩(wěn)狀態(tài)發(fā)生變化。

高濕；細(xì)胞因子；液相芯片；大鼠

高濕作為一種特殊的環(huán)境氣候條件，對機(jī)體可產(chǎn)生多方面的影響，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生多種病理生理的改變[1-2]。細(xì)胞因子(cytokine)主要作為細(xì)胞間信號傳遞分子，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)等，但高濕對機(jī)體血清細(xì)胞因子表達(dá)的影響少有報(bào)道。近年研究發(fā)現(xiàn)，Th1類和Th2類淋巴細(xì)胞的平衡在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，可作為反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)[3-4]。只有當(dāng)Th1/Th2類淋巴細(xì)胞達(dá)到相對平衡，才能維持機(jī)體正常的免疫狀態(tài)和正常生理活動。液相芯片技術(shù)是集流式細(xì)胞、激光、數(shù)字信號處理及傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體的新型生物分子檢測技術(shù)，最大特點(diǎn)是通量大、靈活性好[5]。本課題應(yīng)用液相芯片技術(shù)，就高濕環(huán)境對大鼠血清細(xì)胞因子的影響做一初步研究，為研究高濕對機(jī)體功能影響的指標(biāo)尋找實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 32只3～4月齡清潔級健康雄性SD大鼠，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：scxk(川)2008-24，體重(180±10)g，飼養(yǎng)于清潔環(huán)境。

1.2 儀器及試劑 RXZ-1000A-zl多段編程人工氣候箱(寧波江南儀器廠)， Sorvell ST16R臺式冷凍離心機(jī)，SANYO MDF-U53V -80 ℃低溫冰箱，細(xì)胞因子檢測試劑盒(RECYTMAG-65K Kit，Millipore公司)，Luminex200液相芯片分析系統(tǒng)(美國Luminex公司)。

1.3 動物模型制作 32只SD大鼠隨機(jī)分為兩組，高濕組與正常組，每組16只大鼠。采用人工氣候箱模擬高濕環(huán)境，條件設(shè)置為溫度25 ℃、相對濕度90%～95%，高濕組大鼠每天置于箱中10 h，其余時(shí)間與常溫常濕正常組一樣飼養(yǎng)于清潔環(huán)境(溫度25 ℃，相對濕度45%～50%)，連續(xù)處理20 d。

1.4 標(biāo)本收集和檢測 高濕模型建立后，乙醚麻醉，取大鼠腹主動脈血2 ml，離心(3000 r/min，10 min)分離血清，分裝后-80 ℃保存待測。每個(gè)樣品取25 μl，采用Luminex200液相芯片系統(tǒng)測定各組血清樣本中9種細(xì)胞因子，分別為IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、EGF、IFNα、IFN-γ。

2 結(jié)果

從表1可見，與正常組比較，高濕組IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10血清水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，IFNγ明顯下降(P<0.01)，而TNFα、EGF、VEGF血清水平變化不明顯(P>0.05)。

表1 兩組細(xì)胞因子的比較(n=16)

注：與正常組比較，①P<0.05，②P<0.01

3 討論

液相芯片技術(shù)與現(xiàn)有的臨床診斷方法比較具有明顯的優(yōu)勢，如樣本用量少、特異性敏感性強(qiáng)、高通量等。目前該技術(shù)在臨床和科研上得到推廣[6]，尤其在檢測細(xì)胞因子方面應(yīng)用廣泛，成為多因子分析研究的趨勢[7]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用該技術(shù)探討了高濕對大鼠血清細(xì)胞因子表達(dá)的影響，結(jié)果重復(fù)性好，靈敏度高，為下一步趨化因子的研究打下基礎(chǔ)。

根據(jù)所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的功能不同，輔助性T淋巴細(xì)胞(TH)可分為Th1和Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)宿主對病毒與胞內(nèi)病原體感染的免疫性和防御功能；Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-10、IL-4等，主要功能為介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和促進(jìn)B細(xì)胞發(fā)育，與感染的進(jìn)展、持續(xù)性和慢性化有關(guān)。正常狀態(tài)下，機(jī)體中的Th1/Th2細(xì)胞處于相對平衡的狀態(tài),一旦Th1/Th2 之間的平衡狀態(tài)被打破，很可能造成人體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)平衡被破壞，進(jìn)而引起許多疾病的產(chǎn)生和發(fā)展[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濕組IL-6、IL-10顯著升高，而Th1類細(xì)胞因子除IL-2顯著升高與IFN-γ降低外，TNF-α沒有明顯變化，提示在高濕環(huán)境下，Th2類細(xì)胞因子免疫反應(yīng)較強(qiáng)，而Th1類細(xì)胞因子免疫反應(yīng)較弱，兩者的平衡出現(xiàn)變化，造成機(jī)體免疫自平衡失調(diào)，這與Carlini等[9]的研究結(jié)果一致。他們通過研究大鼠IL-2、IL-8水平變化探討濕邪致病與細(xì)胞免疫功能的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)外濕組的IL-2和IL-8水平較常溫常濕組顯著升高，提示外濕與機(jī)體的免疫激活和炎癥反應(yīng)密切有關(guān)。以上結(jié)果說明高濕對大鼠的免疫功能有一定影響，可導(dǎo)致大鼠免疫功能紊亂，Th1/Th2可以做為探討高濕對大鼠免疫功能影響的檢測指標(biāo)之一。

IL-1是體內(nèi)炎性級聯(lián)反應(yīng)的始動因子，IL-1產(chǎn)生后可上調(diào)E-選擇素和細(xì)胞間黏附分子-1(intracelluar adhension molecule-1)等黏附分子的表達(dá)水平，使中性粒細(xì)胞浸潤量急劇增加，后者又通過釋放細(xì)胞毒性產(chǎn)物、氧自由基以及阻塞微血管等機(jī)制而導(dǎo)致細(xì)胞損傷、凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高濕處理大鼠后體內(nèi)的IL-1α、IL-1β均出現(xiàn)顯著升高，提示高濕可導(dǎo)致大鼠易感染性，進(jìn)而產(chǎn)生炎性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[10]。而IL-10做為一種多潛能炎癥抑制因子，在正常狀態(tài)中低表達(dá)，高濕環(huán)境可誘導(dǎo)IL-10表達(dá)升高，可能是由于大鼠體內(nèi)自身的免疫抵抗能力所致，為抵抗高濕對機(jī)體產(chǎn)生一定的炎性反應(yīng)起到保護(hù)作用。另外表皮生長因子(EGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在本實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到顯著性的變化，初步說明高濕對大鼠體內(nèi)的生長因子的表達(dá)影響較小，也有可能是本實(shí)驗(yàn)樣本量不夠大、高濕作用時(shí)間不夠長所致。

綜上所述，高濕環(huán)境可引起大鼠血清細(xì)胞因子的改變，Th1/Th2平衡被打破，使大鼠的免疫自穩(wěn)狀態(tài)發(fā)生變化，炎癥因子IL-1、IL-6顯著升高，大鼠易被感染，對生長因子類細(xì)胞因子影響不明顯。下一步本課題將加大樣本量和高濕作用時(shí)間，同時(shí)研究高濕對大鼠血清中相關(guān)趨化因子表達(dá)的影響，進(jìn)一步說明高濕對機(jī)體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的影響。

[1] 陳剛,張六通.外濕模型大鼠胃腸激素變化的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2007,45(10):87-88.

[2] 章敏,陳剛,張六通,等.外濕模型大鼠腸道菌群及其黏附性研究[J].中醫(yī)研究,2007,20(9):9-11.

[3] Postal M,Peli?ari KO,Sinicato NA,et al.Th1/Th2 cytokine profile in childhood-onset systemic lupus erythematosus[J].Cytokine,2013,61(3):785-791.

[5] 謝沖,王國民.Luminex液相芯片的發(fā)展及應(yīng)用[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)，2010,37(2):241-244.

[6] 張保強(qiáng),張曉.Luminex液態(tài)芯片在臨床及科研中的應(yīng)用[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012,18(4):18-20.

[7] Djoba Siawaya JF,Roberts T,Babb C,et al.An evaluation of commercial fluorescent bead-based luminex cytokine assays[J].PLoS One,2008,3(7):e2535.

[8] 姚金晶,陳宜濤.Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)與疾病發(fā)生的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009,9(13):2597-2600.

[9] Carlini Fan Hardi,張?jiān)娷?基于IL-2、IL-8水平變化的濕邪致病機(jī)理研究[J].中國中醫(yī)藥咨訊,2010,2(1):10-11.

[10] 劉健,萬磊,盛長健，等.佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠肺功能變化與Th1/Th2細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的相關(guān)性研究[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2011,27(1):56-60.

Liquid phase chip inspection of the effects of humidity environment on the expression of T lymphocyte in rats

Song Fuqiang1,Guo Wenqiong2,Li Kun1,Yang Yun1,Guo Xin1,Li Wei1,Hu Yonghe1

1.Central Lab,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China;2.School of Nursing,Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan,610083,China

Objective To detect the expression of T lymphocyte in rats' blood serum by liquid phase chip technology,and to discuss the influence of high humidity environment on rats' body functions.Methods Thirty two SD rats were randomly divided into high humidity and normal groups with 16 ones in each group.Climatic cabinet was used to simulate the high humidity environment.The temperature was 25 ℃,and the relative humidity was 90%-95% RH.The rats of the high humidity group were placed in the cabinet for 10 h everyday.In the rest of the day,they were feed in the same clean environment as the normal group with common temperature and humidity(temperature of 25 ℃ and relative humidity of 45%-50% RH)continuously for 20 days.After the establishment of the animal model,the blood samples were obtained from the abdominal aorta of the rats in order to isolate the serum.Luminex200 system was used to detect the expression of nine cytokines.Results Compared with the indexes of the normal group,the levels of serum IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-6,and IL-10 in the high humidity group significantly increased(P<0.05 orP<0.01);FNγ obviously decreased(P<0.01);the TNFα,EGF,and VEGF did not change significantly(P>0.05).Conclusion High humidity can change the expression of serum cytokines in rats.The Th1/Th2 cytokine balance is broken,which results in the changes of the rats' immune homeostasis status.

high humidity;cytokine;liquid phase chip;rat

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS11J067)

610083 成都，成都軍區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室(宋富強(qiáng)，李 昆，楊 蕓，郭 鑫，李 薇，呼永河)；成都醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院(郭文瓊)

呼永河，電話：028-86570206；E-mail:huyonghe@vip.126.com

R 229

A

1004-0188(2014)01-0001-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.01.001

2013-11-21)