高海拔地區FISH法檢測乳腺癌HER2基因的方法改進

潘鑫艷，蔡 琳，黎貴蕓，楊長紹，楊舉倫，王 麗

高海拔地區FISH法檢測乳腺癌HER2基因的方法改進

潘鑫艷，蔡 琳，黎貴蕓，楊長紹，楊舉倫，王 麗

目的 在高海拔地區改良并簡化乳腺癌HER2 FISH法檢測的預處理步驟，節省實驗時間，擴大FISH檢測試劑盒的臨床應用。方法 以10例HER2免疫組化染色結果為++以上的乳腺癌標本為研究對象，采用美國PanPath公司的HER2 FISH檢測試劑盒，將其中的預處理步驟改良為高壓煮沸處理，比較常規法與改良法對HER2基因擴增結果的影響。結果 兩種方法檢測乳腺癌HER2基因的陽性率無統計學差異，并且均能使細胞間質完全消化，細胞或重疊或孤立，細胞核中紅綠信號清晰。結論 改良FISH法可以替代常規預處理步驟，簡化了步驟，節省了時間，擴大了FISH檢測試劑盒的臨床應用。

乳腺癌；FISH技術；HER2基因

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發病率呈逐年上升的趨勢，在我國有些城市已躍居女性惡性腫瘤的第一位[1]。人表皮生長因子受體-2(HER2)在乳腺癌患者的高水平表達，對臨床治療方案的選擇有指導作用，尤其是針對單克隆抗體赫塞汀(Herceptin)的臨床應用[2]。目前，應用FISH技術檢測乳腺癌患者HER2基因擴增是美國FDA承認的能進行Herceptin治療的金標準[3]。

FISH法檢測步驟中，加探針之前的石蠟切片消化處理較繁瑣，處理時間過長，若能采用改良FISH法，簡化對切片進行處理的繁瑣步驟，達到不影響FISH結果的判讀，又能得到省時、省力、省試劑的效果，必將會促進FISH檢測在臨床的應用。本研究采用常規FISH法和改良FISH法對10例浸潤性乳腺癌HER2基因進行FISH檢測，比較這兩種方法檢測HER2基因的陽性率以及紅綠信號強度、結果判讀之間的差異。

1 材料與方法

1.1 驗地氣候條件 本實驗在海拔1890 m、大氣壓80.6 kPa、水的沸點為93.4 ℃的昆明地區進行。

1.2 材料與設備 選取本科2012～2013年的浸潤性乳腺癌免疫組化HER2染色陽性++以上的石蠟組織標本10例，連續4 μm切片2張，于60 ℃烤2～4 h，室溫保存。美國PanPath公司生產的FISH檢測試劑盒，購自北京中杉公司。Olympus BX51顯微鏡。

1.3 標本處理

1.3.1 常規FISH法 參照PanPath HER2試劑盒說明書進行：(1)脫蠟至無水酒精2次，甲醇孵育5 min，空氣干燥。(2)預處理：①0.003%～85%甲酸溶液室溫孵育20 min后，0.01M HCl清洗3 min；②70%、90%、100%酒精連續酸性系列脫水后空氣干燥10 min；③80 ℃預熱的處理液NaSCN中孵育10 min，0.01M HCl清洗3 min，重復步驟②；④37 ℃預熱的酸性蛋白水解酶工作液孵育8 min，0.01M HCl清洗3 min，重復步驟②；⑤Post-fix solution室溫孵育15 min；⑥PBS室溫漂洗15 min；(3)去離子水漂洗5 min；(4)70%、90%、100%酒精中性脫水后空氣干燥。(5)探針變性雜交：加探針，80 ℃變性5 min，37 ℃雜交過夜(16 h 以上)。(6)洗滌及漂洗：PBS中去除蓋玻片，PanWash3洗滌及PBS漂洗，梯度酒精脫水，避光干燥10 min，在每張切片上滴加10 μl 二脒基苯基吲哚(DAPI)，蓋上蓋玻片；避光放置15 min，鏡下觀察。

1.3.2 改良FISH法 將上述“(2)預處理”改為高壓煮沸，并對高壓煮沸的時間進行摸索，分別設為4、6、8 min。具體步驟如下：(1)脫蠟至無水酒精，空氣干燥。(2)去離子水中高壓煮沸：高壓鍋大量噴氣時開始計時4～8 min，室溫晾干；37 ℃預熱的酸性蛋白水解酶工作液孵育8 min；(3)去離子水漂洗5 min；(4)70%、90%、100%酒精中性脫水后空氣干燥。后續步驟同常規FISH法。

1.4 觀察指標及判斷標準 細胞消化：細胞間質消化徹底，可見清晰、重疊或孤立的細胞核，細胞間質幾乎不存在；細胞間質消化不足時，可見細胞間質存在，細胞核之間無明顯界限；細胞間質消化過度，細胞間質完全不存在，細胞核呈空洞現象。

結果判讀：同一顯微鏡100×物鏡下隨機計數20個乳腺癌細胞核中的雙色信號：(1)若HER2基因擴增(紅色信號)與17號染色體信號(綠色信號)的比值<1.8，提示HER2基因無擴增；(2)若該比值>2.0，提示HER2基因陽性擴增；(3)若比值為1.8～2.0，則需要再計算20個細胞核中的信號或由另一個分析者重新計數，如仍為臨界值，則應直接注明或重復進行FISH檢測；(4)若紅色信號成簇，兩個綠色信號，提示HER2基因陽性并成簇擴增，其中17號染色體為二倍體；(5)若紅色信號成簇，多個綠色信號，提示HER2基因陽性并成簇擴增，其中17號染色體為多倍體。

2 結果

乳腺癌細胞核DAPI染成藍色，紅色熒光為HER2基因，17號染色體著絲粒序列標記綠色熒光。

2.1 常規FISH法檢測乳腺癌HER2擴增結果(圖1) 10例標本中，7例發生HER2基因擴增，陽性率為70%。可見細胞間質消化徹底，容易計數單個細胞及其紅綠信號，但預處理步驟需要4～5 h完成。

2.2 改良FISH法檢測乳腺癌HER2擴增結果(圖2)

2.2.1 不同高壓時間對組織消化的影響 高壓鍋大量噴氣時開始計時，若高壓煮沸時間為4 min時，細胞間質消化不完全(圖2a)；高壓煮沸時間為6 min時，細胞間質消化徹底(圖2b)；高壓煮沸時間為8 min，細胞間質消化過度(圖2c)。

2.2.2 改良FISH法檢測乳腺癌HER2擴增結果(圖3) 用改良法(將預處理步驟改為高壓煮沸6 min)檢測上述10例標本，結果顯示：7例標本發生HER2基因擴增，陽性率為70%，并且該7例標本與常規FISH法的陽性標本一致，處理過程只需要1.5 h，大大縮短了實驗時間，節省了試劑。

圖1 乳腺癌HER2基因FISH常規法檢測結果

a：17號染色體為2倍體，HER2基因無擴增;b：17號染色體為2倍體，HER2基因擴增

圖2 不同高壓煮沸時間檢測結果

a：細胞間質消化不完全;b：細胞間質消化徹底;c：細胞消化過度

圖3 乳腺癌HER2基因FISH改良法檢測結果

a：17號染色體為2倍體，HER2基因無擴增;b：17號染色體為多倍體，HER2基因擴增

3 討論

乳腺癌患者中，約有20%～30%的HER2基因的擴增和(或)蛋白過表達，與乳腺癌的復發、轉移、不良預后密切相關，對臨床治療也有一定的指導意義[4]。該基因過表達提示乳腺癌惡性程度高，有轉移傾向，通過檢測HER2水平可對患者預后進行評判，為治療方案的選擇提供依據。美國食品和藥品管理局(FDA)認可的HER2基因檢測方法有IHC法、FISH和CISH法，而FISH技術能準確地反映HER2基因狀態，被譽為“金標準”[3,5]。

FISH技術會受到諸多因素的影響，但最主要的影響因素卻是組織固定和切片的前期處理[6]。王躍華等[7]對PanPath公司的試劑盒常規預處理與已成熟用于顯色原位雜交(chromogenic in situ hybridization，CISH)法(改良法)進行了比較，結果發現常規法優于改良法，改良法細胞間質消化不完全，雖然細胞核中紅綠信號清晰，但不易計數單個無重疊細胞，但卻表明簡化預處理步驟具有可行性。 FISH法檢測過程中，石蠟切片預處理步驟較繁瑣(見“1.3.1 常規FISH法”)，處理時間長，整個過程需要4～5 h，浪費了大量時間。為了既能簡化FISH檢測試劑盒的復雜的預處理步驟，又能獲得穩定和準確的實驗結果，達到省時、省力、省試劑的效果。本研究用去離子水煮沸的方法代替常規FISH法步驟(2)的全部處理。考慮昆明大氣壓低，水的沸點低，僅為93.4 ℃，煮沸效果與海平面地區應有差異[8]。市售家用壓力鍋的公稱壓力均為80 kPa，昆明地區的大氣壓強約為80.6 kPa，其噴氣時水的溫度為111.8 ℃，在大氣壓強為100 kPa的地區(海平面)，80 kPa壓力鍋噴氣時水溫為113.7 ℃，二者相差僅1.9 ℃。如果用單純煮沸加熱或微波煮沸加熱，則昆明地區與海平面水的沸點相差6.6 ℃(100 vs.93.4)[8]。因此，本研究采用高壓煮沸代替普通煮沸，并摸索最佳煮沸時間，才能達到預期效果。

本實驗結果顯示：常規FISH法檢測10例浸潤性乳腺癌免疫組化HER2染色陽性++以上的石蠟組織標本的陽性率與改良FISH法相同。改良FISH法處理的乳腺癌石蠟組織細胞間質被完全消化，只留下單個的細胞或重疊或孤立，在熒光顯微鏡下清晰可見單個細胞，計數大小一致、無重疊、核邊界完整、DAPI染色均一、信號清晰的細胞核比較容易，與常規FISH法處理的結果無差異，完全可以代替常規FISH法來檢測乳腺癌HER2基因。而且改良FISH法步驟簡單易操作，只需在去離子水中高壓煮沸6 min(高壓鍋大量噴氣時開始計時)，蛋白酶消化時間縮短至1 h ，就可以進行后續的探針與變性，在實際工作中節省了時間，也增加了FISH檢測HER2試劑盒在高海拔地區的應用范圍。從原理上分析，高壓煮沸的處理方法同樣可以代替其他公司的FISH檢測試劑盒中的普通煮沸法，但由于不同高海拔地區的大氣壓強不同，各地應摸索適合自己實驗室的高壓煮沸時間。在低海拔地區通常采用普通煮沸法，煮沸時間需要15～30 min，而采用高壓煮沸方法來代替，可以將時間縮短到幾分鐘，甚至比在高海拔地區需要的時間更短，可減少實驗時間，提高工作效率。

[1] 上海市疾病預防控制中心.2006 年上海市市區惡性腫瘤發病率[J].腫瘤，2009,29(9):918.

[2] 孔令非,薛趙,許宋崔.乳腺癌人表皮生長因子受體-2基因擴增的意義[J].當代醫學,2012,18(31):8-10.

[3] 梁茱,李曉娟,蔡俊宏,等.熒光原位雜交檢測乳腺癌Her-2基因的表達及其意義[J].中國熱帶醫學,2011,11(8):940-944.

[4] Arafah M,Kfoury HK,Zaidi SN.HER2/neu immunostaining in invasive breast cancer:analysis of false positive factors[J].Oman Medical Journal,2010,25(4):261-263.

[5] 劉彤華.表皮生長因子受體家族與靶向性抗癌治療[J].中華病理學雜志,2006,35(7):577-579.

[6] 趙繼紅,盧義生,王曉文,等.熒光原位雜交技術檢測乳腺癌HER2 基因狀態的影響因素[J].中國熱帶醫學,2009,9(4):640-641.

[7] 王躍華,白瑋,李麗,等.熒光原位雜交法檢測HER2基因狀態過程中兩種切片預處理方法的對比[J].腫瘤研究與臨床,2008,20(12):841-842.

[8] 楊舉倫,宋蜀伶,李霞,等.高海拔地區不同抗原修復方法對免疫組化染色結果的影響[J].解放軍醫學雜志,2005,30(12):1115-1117.

Improvement in the detection of HER2 gene in breast cancer by fluorescence in situ hybridization at high altitude

Pan Xinyan,Cai Lin,Li Guiyun,Yang Changshao,Yang Julun,Wang Li

Department of Pathology,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To improve and simplify the pretreatment procedure of fluorescent in situ hybridization(FISH)technique in the detection of HER2 gene in breast cancer tissues at high altitude,and to save the experiment time and promote the clinical application of FISH detection kit.Methods Ten breast cancer samples which had the HER2 immunohistochemistry staining results of ++ were selected as the subjects.FISH kits from American PanPath company were used to change the pretreatment procedure into high-pressure boiling.Comparison was made in the effects of conventional and modified methods on the amplification of HER2 gene.Results There was no significant difference in the positive rate of HER2 gene detected by the two methods which both could make the intercellular substance digestion completely,the cells overlapped or isolated,and the red and green signal in the cell nucleus clear.Conclusion The modified FISH method can take the place of the common pretreatment,simplify the procedure,save the time,and promote the clinical application of the FISH detection kit.

breast cancer;fluorescence in situ hybridization;HER2 gene

國家自然科學基金項目(81201759)；云南省應用基礎研究項目(2012FB210)

650032 昆明,成都軍區昆明總醫院病理科

王 麗，E-mail：2001wl@163.com

R 737.9

A

1004-0188(2014)01-0017-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.01.007

2013-09-12)