縫線黏附重組pcDNA3-GDNF-GFP質(zhì)粒在周圍神經(jīng)損傷中的實(shí)驗(yàn)研究

何 睿，蔣電明

縫線黏附重組pcDNA3-GDNF-GFP質(zhì)粒在周圍神經(jīng)損傷中的實(shí)驗(yàn)研究

何 睿，蔣電明

目的 研究周圍神經(jīng)損傷后新的修復(fù)方法，了解攜帶含膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)基因重組質(zhì)粒的縫合線對(duì)損傷的周圍神經(jīng)修復(fù)的影響。方法 使用prolene線浸泡于0.1%的左旋多聚賴氨酸和質(zhì)粒等體積液并凍干，反復(fù)3次后使縫線黏附上質(zhì)粒DNA。50只雌性Wistar大鼠制成右側(cè)坐骨神經(jīng)缺損動(dòng)物模型，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各25只。實(shí)驗(yàn)組使用黏附pcDNA3-GDNF-GFP的縫線，對(duì)照組使用黏附pcDNA3的縫線進(jìn)行坐骨神經(jīng)的縫合修復(fù)。術(shù)后1 w、8 w使用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)GDNF在神經(jīng)修復(fù)處的表達(dá)，于坐骨神經(jīng)吻合處取材行免疫組化檢測(cè)；手術(shù)后12 w行右側(cè)坐骨神經(jīng)電生理檢查。結(jié)果 攜帶pcDNA3-GDNF-GFP重組質(zhì)粒的縫線修復(fù)周圍神經(jīng)時(shí)，該質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)染周圍神經(jīng)并得到表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)的傳導(dǎo)速度、動(dòng)作電位的峰值及潛伏期分別是(19.82±1.90)m/s、(3.47±0.32)mV、(0.36±0.03)ms，明顯優(yōu)于對(duì)照組。結(jié)論 使用攜pcDNA3-GDNF-GFP重組質(zhì)粒的縫線修復(fù)損傷的周圍神經(jīng)，可以促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生。

神經(jīng)；再生；縫線；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；質(zhì)粒；修復(fù)

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)是一種具有重要生物活性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，其促進(jìn)神經(jīng)元存活，參與神經(jīng)細(xì)胞程序化死亡，并在軸突損傷的修復(fù)方面起著重要的作用[1]。本實(shí)驗(yàn)用攜帶pcDNA3-GDNF-GFP重組質(zhì)粒的縫線修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)，驗(yàn)證其作為載體的可行性。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒的提取與純化 重組質(zhì)粒pcDNA3-GDNF-GFP與pcDNA3，由重慶醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供，使用Qiagen公司的Endofree Plasmid Giga試劑進(jìn)行質(zhì)粒的提取和純化，最終濃度為5 mg/ml。

1.2 縫線的制備 采用美國強(qiáng)生公司10/0 prolene線。用0.1%的左旋多聚賴氨酸(Sigma公司)和質(zhì)粒進(jìn)行等體積混合，使其終濃度為2.5 mg/ml。將prolene線浸泡于混合溶液中， 24 h后取出凍干，再浸泡于此溶液中，重復(fù)3次，共浸泡72 h后，將制備的縫線置于無菌Eppendorf管內(nèi)，存放于低溫冰箱備用。經(jīng)紫外分光光度儀檢測(cè)，縫線質(zhì)粒含量約為2.5 μg/cm。

1.3 神經(jīng)離斷動(dòng)物模型 雌性Wistar大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(渝)2012-003]，體重約250 g，共50只，采用完全隨機(jī)分段分組法分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各25只。經(jīng)3.5%水合氯醛按1 ml/100 g行腹腔注射麻醉，于無菌條件下作右臀部斜切口，顯露右坐骨神經(jīng)，距梨狀肌下緣0.5 cm處切斷，實(shí)驗(yàn)組使用黏附pcDNA3-GDNF-GFP的縫線、對(duì)照組使用黏附pcDNA3的縫線，端端對(duì)線縫合神經(jīng)外膜8針。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大體觀察 術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)大鼠，按設(shè)定時(shí)間段觀察步態(tài)、雙下肢肌肉、右足腫脹和足底潰瘍的情況。

1.4.2 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè) 兩組于術(shù)后1 w、8 w各取5只大鼠，以3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取距吻合口上下各0.5 cm共約1 cm長神經(jīng)，OTC包埋后立刻冰凍切片(40 μm)，用Leica TCS SP2激光共聚焦顯微鏡直接觀察熒光表達(dá)。

1.4.3 免疫組化檢測(cè) 術(shù)后1 w、8 w分別處死兩組各10只大鼠，于坐骨神經(jīng)吻合處切片，使用中杉公司試劑并按說明行GDNF免疫組化檢測(cè)。

1.4.4 神經(jīng)電生理測(cè)定 術(shù)后12 w，兩組各10只大鼠以3.5%水合氯醛腹腔麻醉后，顯露右側(cè)坐骨神經(jīng)，刺激電極在吻合口近端鉤住坐骨神經(jīng)，接收電極于吻合口以遠(yuǎn)刺入坐骨神經(jīng)，地線刺入對(duì)應(yīng)的股二頭肌。使用成都泰盟公司BL-410生物機(jī)能系統(tǒng)，刺激強(qiáng)度0.2 V，波寬0.1 ms，延時(shí)5 ms，單刺激。找出誘發(fā)動(dòng)作電位的閾值和最大刺激后，再重復(fù)刺激3次，待顯示動(dòng)作電位穩(wěn)定后，計(jì)算潛伏期、神經(jīng)傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位峰值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 所有大鼠的傷口均一期甲級(jí)愈合。術(shù)后即出現(xiàn)患側(cè)拖足步態(tài)，足下垂，患側(cè)肢體腫脹且著地時(shí)間明顯縮短。2 w后腫脹開始減退；術(shù)后3 w，兩組患側(cè)腓腸肌均嚴(yán)重萎縮，手術(shù)側(cè)足部仍紅腫；術(shù)后8 w步態(tài)有好轉(zhuǎn)，實(shí)驗(yàn)組腓腸肌萎縮，對(duì)照組足部均出現(xiàn)潰瘍；12 w后，實(shí)驗(yàn)組腓腸肌萎縮恢復(fù)，對(duì)照組潰瘍愈合，但肌萎縮明顯。

2.2 熒光檢測(cè) 術(shù)后1 w，激光共聚焦顯微鏡下，實(shí)驗(yàn)組縫合處可見強(qiáng)烈熒光蛋白表達(dá)，陽性細(xì)胞分布均勻，大小不等，部分胞體較大，可能是雪旺細(xì)胞，胞體較小可能是淋巴細(xì)胞或成纖維細(xì)胞(圖1A)；8 w時(shí)表達(dá)減少，熒光減弱，但仍可以檢出。對(duì)照組未檢出熒光蛋白(圖1B)。

圖1 術(shù)后1 w激光共聚焦(×200)

2.3 免疫組化結(jié)果 1 w時(shí)，實(shí)驗(yàn)組GDNF陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，兩組的GDNF陽性細(xì)胞在8 w時(shí)均下降，但實(shí)驗(yàn)組仍高于對(duì)照組(圖2)，兩者比較有顯著差異(P<0.01，表1)。

圖2 術(shù)后8 w免疫組化染色(×200)

組別 1w8w實(shí)驗(yàn)組0.56±0.11①0.38±0.07①對(duì)照組0.36±0.08 0.17±0.05

注：與同時(shí)間對(duì)照組相比，①P<0.01

2.4 神經(jīng)電生理測(cè)定結(jié)果 術(shù)后12 w，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)作電位潛伏期短于對(duì)照組，神經(jīng)傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位峰值均較對(duì)照組高(P<0.01，表2)。

表2 術(shù)后12 w神經(jīng)電生理檢測(cè)結(jié)果(n=10)

注：與對(duì)照組相比，①P<0.01

3 討論

周圍神經(jīng)損傷后，在其遠(yuǎn)、近端及間隙中形成的具有促神經(jīng)生長的細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和營養(yǎng)神經(jīng)物質(zhì)被稱為周圍神經(jīng)再生的微環(huán)境。許多研究證實(shí)，周圍神經(jīng)損傷后，能否可以成功的再生，主要依靠其是否具有適合的微環(huán)境條件。神經(jīng)營養(yǎng)因子是其中的重要因素，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和再生中起著重要作用[2]。這種機(jī)制主要包括：(1)保持感覺、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活；(2)加快神經(jīng)再生速度；(3)誘導(dǎo)分化神經(jīng)生長方向。因此，在周圍神經(jīng)損傷后的再生微環(huán)境中，加入外源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子可以促進(jìn)其修復(fù)。

GDNF是近年神經(jīng)營養(yǎng)因子研究的熱點(diǎn)之一，許多研究已證明GDNF對(duì)損傷神經(jīng)有保護(hù)作用，GDNF是TGF-β超家族中最具有潛力的營養(yǎng)因子。目前已發(fā)現(xiàn)它能促進(jìn)人體內(nèi)許多種細(xì)胞群的存活，包括缺血、損傷狀態(tài)下的中樞和外周神經(jīng)、脊髓的自主神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞等[3-7]。GDNF的分子量為15 kDa，是一種分泌蛋白，是靶源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，可通過逆轉(zhuǎn)運(yùn)或旁分泌作用對(duì)神經(jīng)元起營養(yǎng)作用[8-10]。

選擇適合的載體，將編碼GDNF的基因?qū)霌p傷部位使其穩(wěn)定并高效的表達(dá)，發(fā)揮營養(yǎng)、促進(jìn)神經(jīng)再生的作用，對(duì)周圍神經(jīng)損傷后的治療有積極意義。目前研究的GDNF基因載體主要有：(1)脂質(zhì)體介導(dǎo)的GDNF轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞；(2)病毒載體；(3)質(zhì)粒，作為非病毒載體，目前質(zhì)粒在基因治療中的應(yīng)用前景最引人注目[11]。質(zhì)粒DNA和重組病毒相比，操作更簡單，容納的插入序列更大，擴(kuò)散整合的危險(xiǎn)性更小，容易制備、成本很低。質(zhì)粒DNA的抗原性較低，可以多次反復(fù)投藥而不會(huì)引起嚴(yán)重免疫的反應(yīng)。

現(xiàn)階段使用重組載體增加神經(jīng)再生微環(huán)境中的神經(jīng)營養(yǎng)因子大多采用注射方法，通常采用肌肉內(nèi)注射、神經(jīng)中注射、皮下注射和灌注等。這些方法有一定操作難度，作用時(shí)間較短暫，神經(jīng)注射后可出現(xiàn)軸索損傷和脫髓鞘等改變[12]。本實(shí)驗(yàn)采用攜質(zhì)粒DNA的prolene線作為載體，使用攜重組pcDNA3-GDNF-GFP質(zhì)粒的縫線修復(fù)神經(jīng)損傷，使得神經(jīng)的修復(fù)和營養(yǎng)因子的導(dǎo)入一步完成，既可以減少損傷，又能簡化操作。在縫線制備時(shí)，使用0.1 %的右旋多聚賴氨酸作為黏合劑，同時(shí)右旋多聚賴氨酸帶正電荷，質(zhì)粒DNA帶負(fù)電荷，兩者電荷相吸亦可促進(jìn)質(zhì)粒的黏附。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，縫線攜帶DNA修復(fù)損傷的坐骨神經(jīng)，質(zhì)粒DNA可以釋放并轉(zhuǎn)染表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后8 w仍可觀察到外源性的GDNF-GFP熒光，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)的傳導(dǎo)速度、動(dòng)作電位的峰值和潛伏期明顯優(yōu)于對(duì)照組，動(dòng)物傷肢恢復(fù)也好于對(duì)照組。提示應(yīng)用攜pcDNA3-GDNF-GFP質(zhì)粒的縫線修復(fù)損傷坐骨神經(jīng)，短期內(nèi)可以促進(jìn)軸突再生，降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷殘率，其長期效果還需要進(jìn)一步觀察。但該方法可以避免其他導(dǎo)入方式所引起的損傷和毒副作用，可能成為周圍神經(jīng)損傷后基因治療的一個(gè)新方法。

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Experimental research on peripheral nerve regeneration promoted by suture carrying recombinant plasmid pcDNA3-GDNF-GFP

He Rui1,Jiang Dianming2

1.Department of Orthopaedics,the Second People's Hospital of Chengdu City,Chengdu,Sichuan,610017,China;2.Department of Orthopaedics,the First Affiliated Hospital,Chongqing University of Medical Science,Chongqing,400016,China

Objective To develop a new restorative procedure after peripheral nerve injury,and to explore the effects of the suture carrying glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)recombinant plasmid on peripheral nerve regeneration.Methods Prolene sutures were soaked in the mixed solution of 0.1% poly L lysine and the same volume of plasmid and got freeze dried for consecutive 3 times until the sutures carried the plasmid DNA.Then sutures were stored the sutures in deep freeze refrigerator for later use.Fifty Wistar rats with their right sciatic nerves cut were used as the animal model and randomly divided into experimental and control groups with 25 ones in each group.In the reparation of sciatic nerves,the sutures carrying pcDNA3-GDNF-GFP plasmid were used in the experimental group,while the sutures carrying pcDNA3 were used in the control group.Confocal laser scanning microscope was used to detect the expression of GDNF in the repaired sites of the nerves 1 and 8 w after the operation.Materials in the sciatic neural anastomosic sites were taken for the immunohistochemistry examination.Electeophysiological examination was carried out 12 weeks after the operation.Results In the neural reparation by the sutures carrying pcDNA3-GDNF-GFP recombinant plasmid,the plasmid could transfer the peripheral nerve and be expressed.The neural conduction velocity,peak value of action potential,and the latent period in the experimental group were(19.82±1.90)m/s,(3.47±0.32)mv,and(0.36±0.03)ms,respectively,which were significantly better than those in the control group.Conclusion Using the suture carrying pcDNA3-GDNF-GFP recombinant plasmid in the reparation of the injured peripheral nerves can promote the regeneration of the injured nerves.

nerve;neural regeneration;suture;glial cell line-derived neurotrophic factor;plasmid;reparation

610017 成都，成都市第二人民醫(yī)院骨科(何 睿);重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科(蔣電明)

蔣電明，E-mail：jdm571026@vip.163.com

R 651.3

A

1004-0188(2014)01-0026-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.01.010

2013-08-05)