谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L -賴氨酸的培養(yǎng)優(yōu)化和產(chǎn)酸特性研究

蘇會波，林海龍，羅 虎，周 勇，盧宗梅

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院，國家能源生物液體燃料研發(fā)中心，國家能源生物煉制研發(fā)中心，北京 100020;2.中糧生物化學（安徽）股份有限公司，安徽蚌埠 233010）

L－賴氨酸具有促進發(fā)育、增強免疫力和提高中樞神經(jīng)組織功能等生理功效，是人體和動物不能自身合成且生長必需的8種基本氨基酸之一［1－4］。目前，L－賴氨酸是世界上的第二大氨基酸品種。2012年，國內(nèi)的L－賴氨酸產(chǎn)能約為150萬 t，產(chǎn)量約為100萬t。2013年，國內(nèi)的L－賴氨酸產(chǎn)能增至約230萬t，生產(chǎn)廠家有16家以上，以大成生化、寧夏伊品、中糧生化和希杰等企業(yè)為主［5］。L－賴氨酸約90%用作飼料工業(yè)中的營養(yǎng)強化劑，10%用作食品工業(yè)中的鮮味劑和甜味劑，以及醫(yī)藥行業(yè)中的藥物中間體［6－9］。

目前，L－賴氨酸的研究主要集中在選育高產(chǎn)菌株、開發(fā)新生產(chǎn)工藝和優(yōu)化原發(fā)酵工藝等方面。張偉國等［10］將黃色短桿菌進行誘變得到高產(chǎn)菌株，搖瓶發(fā)酵72h后L－賴氨酸濃度可達77～82g/L。廉少杰等［11］通過發(fā)酵溫度優(yōu)化，將L－賴氨酸發(fā)酵濃度從111g/L提高到151g/L。周勇等［12］對L－賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，在7L發(fā)酵罐中發(fā)酵64h后，L－賴氨酸鹽酸鹽濃度可達161g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率可達58.3%。在其他學者的研究中，很少對L－賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中的成分進行重要性分析和系統(tǒng)性優(yōu)化。因此，作者在研究中利用谷氨酸棒桿菌進行搖瓶培養(yǎng)生產(chǎn)L－賴氨酸，通過響應面分析法和氮源優(yōu)化，對發(fā)酵培養(yǎng)基中的成分進行了重要性分析排序和系統(tǒng)性優(yōu)化，將L－賴氨酸濃度從 1.90g/100mL提高至2.25g/100mL［13］。為了考察優(yōu)化培養(yǎng)基對連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L－賴氨酸的影響，本文在5L發(fā)酵罐中對優(yōu)化培養(yǎng)基和原始培養(yǎng)基連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L－賴氨酸的菌種生長和產(chǎn)酸特性進行了實驗研究和分析，以期能促進L－賴氨酸生產(chǎn)的工藝優(yōu)化和效益提升。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷氨酸棒桿菌B253 上海工業(yè)微生物研究所;原始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖40、（NH4）2SO410、蘇氨酸 0.2、蛋氨酸 0.1、谷氨酸 0.3、KCl 2.4、KH2PO41.2、糖蜜9.0mL、NaCl 1.6、MgSO41.8、FeCl20.8、MnSO41.0 和維生素 B 1.0;優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）［13］葡萄糖 40、（NH4）2SO410、蘇氨酸 0.2、蛋氨酸 0.2、谷氨酸0.21、KCl 2.4、KH2PO41.2、糖蜜 15.7mL、NaCl 1.6、MgSO41.8、FeCl20.8、MnSO41.0 和維生素 B 1.0;發(fā)酵培養(yǎng)基用 6% 氨水將 pH 調(diào)至 6.3～6.4，121℃ 滅菌20min;以上試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

NBS Bioflo 115發(fā)酵罐 艾本德中國有限公司;SBA－40E生物傳感分析儀檢測 山東省科學院生物研究所;UV－1750紫外可見分光光度計 島津企業(yè)管理（中國）有限公司;SW－CJ－1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SX－700滅菌鍋 日本Tomy Digital Biology公司;5418微量臺式離心機 德國艾本德股份公司;PT－15便攜式pH測定儀 賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子罐培養(yǎng) 種子培養(yǎng)在容積為2L的全自動發(fā)酵罐中進行，培養(yǎng)體積為500mL。先用pH緩沖液和飽和亞硫酸鈉溶液校正pH電極和溶氧電極，然后接入菌種開始培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為37±0.5℃，流加25%濃度氨水控制培養(yǎng) pH 為 6.8～7.0，攪拌速度為600r/min，通風量為 0.5L/min。培養(yǎng)周期約為 15～20h，菌種 OD 值（562nm，稀釋 26 倍）為 0.8～1.0 時即可接入發(fā)酵罐。

1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)在容積為5L的全自動發(fā)酵罐中進行，先用pH緩沖液和飽和亞硫酸鈉溶液校正pH電極和溶氧電極，然后接入200mL培養(yǎng)好的種子罐菌種液開始培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（37±0.5）℃，流加25%濃度氨水控制培養(yǎng) pH 為6.8～7.0，攪拌速度為800r/min，通風量為2.0L/min。發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，主要控制參數(shù)為葡萄糖濃度、氨基氮濃度、pH和溶氧，每3h檢測葡萄糖和氨氮濃度并調(diào)整流加速度。發(fā)酵罐培養(yǎng)周期控制在48h左右，發(fā)酵12h后每6h檢測L－賴氨酸濃度。通過流加葡萄糖溶液和（NH4）2SO4溶液調(diào)整發(fā)酵溶液中還原糖濃度和氨基氮濃度，通過調(diào)整通風量和攪拌速度保證溶液中的溶氧充足。發(fā)酵罐中溶液液位隨著流加溶液增多不斷升高，當液位高于2500mL時開始排料，每次排出約100mL料液，裝入封口三角瓶內(nèi)于4℃冷藏，停罐時測量排料體積和L－賴氨酸含量。

1.3 分析方法

1.3.1 pH測定 PT－15便攜式pH測定儀檢測。

1.3.2 OD值測定 發(fā)酵液稀釋26倍后，用 UV－1750紫外可見分光光度計檢測562nm處吸光度。

1.3.3L－賴氨酸和還原糖測定 SBA－40E生物傳感分析儀檢測。

1.3.4 氨基氮測定 Dual Star氨氮測量儀檢測。

1.3.5 總酸計算 總酸（g）=L－賴氨酸濃度（g/mL）×發(fā)酵液體積（mL）。

1.3.6 糖酸轉(zhuǎn)化率計算 糖酸轉(zhuǎn)化率（g酸/g糖）=產(chǎn)酸總量（g）/原料總糖（g）。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種培養(yǎng)

接入種子罐的菌種液 OD值為 0.091，pH為6.89。接入種子罐后，種子罐發(fā)酵液的初始OD值為0.026，初始還原糖濃度為 3.9g/100mL，初始氨基氮濃度為0.345g/100mL，初始 pH 為6.33。發(fā)酵過程中通過流加50%濃度葡萄糖溶液確保還原糖濃度不低于0.3g/100mL。種子培養(yǎng)液中的菌種生長情況（OD值）、還原糖消耗和pH變化情況如圖1所示。

圖1 種子培養(yǎng)的OD值、還原糖消耗和pH變化Fig.1 OD、reducing sugar consumption and pH of seed culture

從圖1可知，種子罐中的pH開始調(diào)整后，基本穩(wěn)定在6.8～7.0。發(fā)酵開始到12h期間，菌種溶液 OD值從初始的0.026增加到0.224。還原糖消耗相對較少，僅從3.8g/100mL 降低到 3.3g/100mL。這是因為接種后菌種需要適應新的發(fā)酵環(huán)境，新陳代謝和自身生長緩慢，碳源消耗速度相對較低。發(fā)酵12h到15h期間，菌種處于快速生長時期，OD值迅速增加到0.549，同時消耗大量還原糖，還原糖濃度快速降低到1.6g/100mL。發(fā)酵16h 時，菌種溶液 OD 值為 0.815，滿足發(fā)酵罐接種要求。此時，還原糖濃度為0.15g/100mL，利用率達96%，種子液中L－賴氨酸濃度為 1.86g/100mL。

種子罐中的氮源消耗如圖2所示。從圖2可知，種子液培養(yǎng)過程中氮源消耗較少，氨基氮僅從初始濃度 0.345g/100mL 下降到終點濃度 0.265g/100mL。這是因為初始培養(yǎng)基中含較豐富（NH4）2SO4，菌種培養(yǎng)剛剛進入對數(shù)生長期，未能大量消耗溶液中的氮源。另外，培養(yǎng)過程中因調(diào)節(jié)溶液pH需流加一定量的氨水，也可以作為氮源被利用。

2.2 發(fā)酵參數(shù)控制

圖2 種子培養(yǎng)的氮源消耗Fig.2 Nitrogen source consumption of seed culture

谷氨酸棒桿菌連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L－賴氨酸過程中，需要控制的主要參數(shù)為還原糖濃度、氨基氮濃度、發(fā)酵溶液的pH和溶氧。發(fā)酵溶液中的還原糖和氨基氮濃度變化如圖3所示。發(fā)酵罐中接入菌種后，菌種逐步利用葡萄糖和（NH4）2SO4快速生長并產(chǎn)出L－賴氨酸。溶液的初始還原糖濃度為1.85g/100mL，發(fā)酵開始后還原糖濃度迅速降低，發(fā)酵12h后低于0.5g/100mL。發(fā)酵溶液中的葡萄糖作為碳源，主要影響微生物的能量代謝、菌體的生長和產(chǎn)物的合成，是至關(guān)重要的原料。發(fā)酵過程中通過流加50%濃度葡萄糖溶液將還原糖濃度維持在0.3～1.5g/100mL，以便能給菌種提供足夠的能量和碳源。發(fā)酵溶液中初始氨基氮濃度為0.118g/100mL，發(fā)酵開始后逐步降低，發(fā)酵12h后低于0.05g/100mL。作為主要氮源，（NH4）2SO4可以為微生物提供豐富的氮元素，促進菌種的自身生長和代謝產(chǎn)酸，同時NH4+和S還可以激活L－賴氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶天冬氨酸激酶［14－15］。產(chǎn)酸過程中通過流加50%濃度（NH4）2SO4溶液將氨基氮濃度穩(wěn)定在0.02～0.12g/100mL，以便能給菌種提供足夠的氮源，但又不產(chǎn)生抑制作用。

圖3 發(fā)酵溶液的還原糖和氨基氮控制Fig.3 Reducing sugar and amino nitrogen control in fermentation

發(fā)酵溶液中的pH、溶氧控制如圖4所示。pH主要會影響微生物的新陳代謝及其對培養(yǎng)基成分的利用，從而影響微生物體內(nèi)酶的活性和產(chǎn)物的代謝途徑。發(fā)酵溶液的初始 pH 為6.3～6.6，發(fā)酵開始后逐步降低。賴氨酸發(fā)酵屬于中性發(fā)酵，發(fā)酵過程中通過流加25%濃度氨水保持溶液pH穩(wěn)定在6.8～7.0，以便谷氨酸棒桿菌能更好地生長和產(chǎn)酸。發(fā)酵溶液中的溶氧主要影響微生物的生長和能量代謝，同時會參與產(chǎn)物的合成。發(fā)酵溶液中初始溶氧為100%，發(fā)酵初期，菌種量少，雖然呼吸強度較大，但總體上需氧量不大，此時發(fā)酵液中的溶氧較高，發(fā)酵6h溶氧約為65%～75%。隨著菌種大量繁殖進入對數(shù)生長期，發(fā)酵液的菌種濃度不斷上升，需氧量也不斷增加，使溶氧濃度明顯下降，發(fā)酵18h下降至40%左右。而且菌種生長和產(chǎn)酸速度越快，溶氧消耗越快。對數(shù)生長期后，菌種的呼吸強度下降，需氧量減少，溶氧經(jīng)過一段時間的平穩(wěn)后開始回升，發(fā)酵結(jié)束后約為65%～85%。發(fā)酵過程中通過將通風量從1.0L/min提高到 2.0L/min，將攪拌速度從 400 轉(zhuǎn)/min提高到600轉(zhuǎn)/min，控制發(fā)酵溶液中的溶氧始終在40%以上，以給菌種提供充足的氧氣用于新陳代謝和產(chǎn)物合成。

圖4 發(fā)酵溶液的溶氧和pH控制Fig.4 DO and pH control in fermentation

2.3 菌種生長和產(chǎn)酸特性

發(fā)酵罐中的菌種生長如圖5所示。谷氨酸棒桿菌在優(yōu)化培養(yǎng)基和原始培養(yǎng)基中的生長趨勢基本一致，接種后均很快進入對數(shù)生長期，在18h菌種量達到最大值，OD 值分別為 1.059和 1.232，對應的細胞干重達到8.0g/L和9.3g/L。菌種在此階段處于旺盛生長時期，生長速率高于0.2g/L/h。發(fā)酵的前6h，菌種生長得最快，此時優(yōu)化培養(yǎng)基和原始培養(yǎng)基中菌種的生長速率達到最高值，分別為0.53g/L/h和0.72g/L/h。發(fā)酵18h后，菌種新陳代謝進入穩(wěn)定期和衰亡期，部分菌種發(fā)生自溶，發(fā)酵液整體生物量均有所降低。發(fā)酵48h到達終點時，優(yōu)化培養(yǎng)基中菌種量為7.7g/L，比最高值降低了3.8%。原始培養(yǎng)基中菌種量為8.3g/L，比最高值降低了10.8%。值得一提的是，整個發(fā)酵過程中，優(yōu)化培養(yǎng)基的菌種生長量和生長速率始終低于原始培養(yǎng)基。

圖5 菌種生長曲線和生長速率Fig.5 Growth curve and rate of Corynebacterium glutamicum

谷氨酸棒桿菌的產(chǎn)酸特性如圖6所示。從圖6可以看出，整個發(fā)酵周期優(yōu)化培養(yǎng)基的產(chǎn)酸速率和L－賴氨酸濃度增長趨勢與原始培養(yǎng)基一致。接種后6～24h是菌種快速產(chǎn)酸時期，該階段優(yōu)化培養(yǎng)基和原始培養(yǎng)基中菌種的最大產(chǎn)酸速率分別達到0.75g/100mL/h 和 0.81g/100mL/h，溶液中L－賴氨酸濃度由初始的 0.26g/100mL分別快速增長到 15.2g/100mL和15.4g/100mL。這是由于菌種在0～18h處于對數(shù)生長期，菌種新陳代謝旺盛，菌種大量繁殖，經(jīng)過短暫延滯作用后代謝產(chǎn)物L－賴氨酸的濃度也相應快速增長。接種后18～36h是菌種新陳代謝的穩(wěn)定期，谷氨酸棒桿菌在此階段不再生長，菌種量基本上保持穩(wěn)定，L－賴氨酸生產(chǎn)速率緩慢降低但仍保持在0.2g/100mL/h以上，L－賴氨酸濃度隨著積累逐步增加。接種36h后，菌種新陳代謝進入衰亡期，L－賴氨酸生產(chǎn)速率進一步降低。發(fā)酵48h到達終點時，優(yōu)化培養(yǎng)基中的L－賴氨酸濃度為20.8g/100mL，比原始培養(yǎng)基中的19.6g/100mL提高了6.1%。

表1 產(chǎn)酸過程中的原料消耗、總酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率Table 1 Material consumption，L－lysine yield and conversion ratio

圖6 發(fā)酵產(chǎn)酸曲線和產(chǎn)酸速率Fig.6 Production curve and rate of L－lysine

2.4 產(chǎn)酸總量和糖酸轉(zhuǎn)化率

發(fā)酵過程中的葡萄糖與（NH4）2SO4消耗情況、產(chǎn)酸總量和糖酸轉(zhuǎn)化率如表1所示。優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵消耗的葡萄糖和（NH4）2SO4分別為 824.6g和200.6g，原始培養(yǎng)基發(fā)酵消耗的葡萄糖和（NH4）2SO4分別為903.8g和 188.6g。相比之下，優(yōu)化培養(yǎng)基比原始培養(yǎng)基少消耗了8.8%的葡萄糖，多消耗了6.4%的（NH4）2SO4，兩種培養(yǎng)基溶液中的C/N（m/m）分別為7.8和9.0。發(fā)酵過程結(jié)束后，優(yōu)化培養(yǎng)基溶液中的產(chǎn)酸總量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為588.2g和0.713g酸/g糖，和原始培養(yǎng)基的574.7g和0.636g酸/g糖相比，分別提高了 2.3% 和 12.2% 。

這可能是由于優(yōu)化培養(yǎng)基成分中的蛋氨酸、糖蜜和谷氨酸含量改變后，培養(yǎng)基中的碳氮比和其他營養(yǎng)成分配比隨之改變，菌種的新陳代謝和生長繁殖機制受到影響，不需消耗過多碳源合成生物體，因此菌種生長速度和總生物量均低于原始培養(yǎng)基。菌種生長進入高速產(chǎn)酸期后，消耗的碳源和氮源主要用來生產(chǎn)L－賴氨酸。優(yōu)化培養(yǎng)基中消耗的C/N為7.8，低于原始培養(yǎng)基中消耗的C/N 9.0。優(yōu)化培養(yǎng)基利用較低的C/N和較少的葡萄糖原料，生產(chǎn)出了更多的L－賴氨酸，說明優(yōu)化培養(yǎng)基更有利于菌種高效利用氮源合成L－賴氨酸。

3 結(jié)論

對谷氨酸棒桿菌連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)L－賴氨酸進行研究后發(fā)現(xiàn)，和原始培養(yǎng)基相比，優(yōu)化培養(yǎng)基中的菌種消耗的碳源較少，總體生物量較低。發(fā)酵結(jié)束后，優(yōu)化培養(yǎng)基中的L－賴氨酸濃度、產(chǎn)酸總量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別比原始培養(yǎng)基提高了 6.1%、2.3% 和12.2%，優(yōu)化培養(yǎng)基進一步提升了L－賴氨酸的發(fā)酵指標和生產(chǎn)效率，為降低工業(yè)生產(chǎn)成本奠定了基礎(chǔ)。

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