青島市售雙殼貝類大腸菌群/大腸桿菌檢出水平與當地氣溫的相關性

武 娟，張 祺，李 丹，曹斌斌，左 濤，薛長湖，唐慶娟，*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003;2.根特大學食品質量與安全系，比利時根特 9000）

雙殼貝類是一種非選擇濾食性生物，在生長過程中易積累和富集環境中的微生物。傳統的加熱烹調方法能夠有效地滅活貝類中的微生物，但隨著生鮮即食食品尤其是貝類等生食海產品的普及，貝類產品的安全衛生質量問題越來越受到人們的重視。

大腸桿菌是人及各種動物腸道中正常菌群，食品中檢出大腸桿菌意味著食品已經被腸道排泄物污染。大腸桿菌作為各種食品的糞源性污染衛生細菌學指標，是國際上公認的衛生檢測指示菌［1］。傳統的微生物檢測方法有國家標準 GB4789.3、行業標準SN0169－92等標準，但整個檢測過程所需時間較長，費時費力，容易造成食品的積壓、影響食品的品質［2］。3M PetrifilmTM測試紙片法檢測大腸菌群和大腸桿菌，具有快捷、準確等優點，檢測結果與傳統方法相比在統計學上無顯著性差異，其可靠性得到國際化認可［3－6］。

氣溫波動對貝類中微生物的生長繁殖具有重要影響，將影響貝類產品的品質、改變其貨架期。在特定的溫度變化范圍內，大腸菌群/大腸桿菌隨著溫度的升高生長繁殖速度加快，即與氣溫變化呈正相關關系［7］。本研究擬采用3M PetrifilmTM測試紙片法，檢測青島市場上三種常見雙殼貝類的大腸菌群/大腸桿菌水平，并且采用斯皮爾曼等級相關系數，進一步分析其與當地氣溫變化的相關性。本研究成果將對貝類產品加工儲運及其衛生質量控制起到一定指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的牡蠣、毛蚶、海虹三種雙殼貝類產品 購于青島市農貿市場;PBS袋裝預混試劑（10mM，pH7.2） 北京康為世紀生物科技有限公司;3M PetrifilmTM大腸菌群/大腸桿菌測試片 美國3M公司;電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;九陽料理機JYL－C012 九陽股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 自2012年10月至2013年3月，牡蠣、毛蚶、海虹三種雙殼貝類樣品每周采購一次，每種樣品采購20個。無菌開殼收集貝類肉，各稱取貝類肉10g分別于無菌的90mL PBS中均質，取1mL均質上清液分別加到9mL PBS中，每種貝類肉作兩個平行測試。每周共6個（3×2）測試樣品，6個月總共測試144個（6×4×6）樣品。

1.2.2 實驗方法 具體操作步驟參照文獻［8］:將PetrifilmTM大腸菌群/大腸桿菌測試片置于平坦實驗臺面，揭開上層膜，用吸管吸取1mL PBS稀釋樣液滴加在測試片的中央，將上層膜緩慢蓋下。把壓板放置在上層膜中央輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養面積上。靜置1min使培養基凝固。將測試片的透明面朝上，水平置于電熱恒溫培養箱內，培養溫度為（36±1）℃。培養24h后，計數紅色和藍色帶有氣泡的菌落數為大腸菌群數cfu/g，計數藍色帶有氣泡的菌落數為大腸桿菌數cfu/g。

當地周平均氣溫根據青島天氣預報查詢網站tianqi.2345.com查詢后，計算統計周平均氣溫。

1.2.3 相關性統計方法 以查爾斯·斯皮爾曼命名的斯皮爾曼等級相關系數，用希臘字母ρ（rho）或者rs表示。它是衡量兩個變量依賴性的非參數指標，利用單調方程評價兩個統計變量的相關性，如果數據中沒有重復值，并且當兩個變量完全單調相關時，斯皮爾曼相關系數則為+1或－1［9］。本文采用斯皮爾曼等級相關系數評價大腸桿菌/大腸菌群與周平均氣溫變化的相關性，計算公式如下:

n為等級個數，d為二列成對變量的等級差數。

2 結果與分析

2.1 三種貝類樣品中的大腸菌群檢出水平及與周平均氣溫變化的相關性

本研究中每10g貝類樣品以PBS稀釋1000倍后進行檢測，根據3M PetrifilmTM測試法檢出限為1cfu/mL，可以推算出:本研究大腸菌群/大腸桿菌的最低檢測限為100cfu/g。若2個平行樣品之一檢測結果為陰性，另一個為100cfu/g，則出現表1中所示的50cfu/g。由表1可知，牡蠣、毛蚶和海虹三種貝類樣品中高水平的大腸菌群檢出集中在檢測期內（2012年10月份）的前3個周，最高水平達到106，從第9周往后，大腸菌群的檢出水平開始降低。為了進一步評價大腸菌群檢出水平與周平均氣溫變化的關系，我們將當地周平均氣溫變化進行了統計，并與每周三種樣品中大腸菌群檢出平均水平做出關系圖（如圖1所示）。結果顯示，在本研究檢測期內周平均氣溫相對較高的前幾周，大腸菌群的檢出水平相對較高;隨著氣溫降低，大腸菌群的檢出水平也隨之降低。經斯皮爾曼等級相關性分析可知，當地周平均氣溫與貝類大腸菌群檢出水平具有高度的正相關性（ρ=0.712）。

表1 PF法檢測貝類中大腸菌群結果（單位:cfu/g）Table 1 Result of PF method for detection of Coliform in shellfish（unit:cfu/g）

2.2 三種貝類樣品中的大腸桿菌檢出水平及與周平均氣溫變化的相關性

由表2可知，48份牡蠣樣品中第2周的兩份平行樣品均檢測出大腸桿菌陽性，平均水平為700cfu/g，毛蚶樣品中第1周的兩份平行樣品均檢測出陽性，平均水平為1100cfu/g，第3、17、21、24 周的兩份樣品中只有一份檢測出陽性結果，平均水平為50cfu/g，海虹樣品中第2、7、9、10周的兩份樣品中只有一份檢測出陽性結果，平均水平為50cfu/g。為了進一步評價大腸桿菌檢出水平與周平均氣溫變化的關系，我們將周平均氣溫與每周的三種樣品大腸桿菌檢出平均水平做出關系圖（如圖2所示）。結果顯示在檢出大腸桿菌的12份陽性樣品中有9份集中在前10周周平均氣溫比較高的月份，而且經過相對較低的氣溫后（第12～20周），從第21周開始氣溫有所回升，大腸桿菌亦重新檢出。經斯皮爾曼等級相關性分析，周平均氣溫與大腸桿菌檢出水平亦有一定的正相關關系（ρ=0.481）。

圖1 大腸菌群與周平均氣溫變化的相關性Fig.1 The correlation between coliforms and average temperature changes per week

表2 PF法檢測貝類中大腸桿菌結果（單位:cfu/g）Table 2 Result of PF method for detection of E.coli in shellfish（unit:cfu/g）

圖2 大腸桿菌與周平均氣溫變化的相關性Fig.2 The correlation between E.coli and average temperature changes per week

上述結果提示:在當地氣溫較高時，貝類受到大腸菌群和大腸桿菌污染情況比較嚴重，需對貝類產品的貯藏運輸及質量控制予以高度重視。

2.3 三種貝類污染大腸菌群/大腸桿菌情況比較

為了分析比較三種貝類污染大腸菌群/大腸桿菌的情況，我們將大腸菌群/大腸桿菌檢出水平按月份進行了統計（如圖3）。在檢測期內，三種貝類中大腸菌群檢出水平以2012年10月份最高，平均水平分別為258025、261988、3800cfu/g，11 月份檢出平均水平分別為 2475、925、1713cfu/g，11 月份之后檢出水平逐漸降低。大腸桿菌檢出水平也是10月份最高，2013年1月份三種樣品大腸桿菌檢出水平均為0cfu/g。牡蠣中大腸桿菌檢出率最低（5%），但是檢出水平較高（平均水平為175cfu/g），發生在檢測期內溫度最高的10月份;毛蚶中大腸桿菌檢出率最高（13%），是三種貝類中最易受大腸桿菌感染的貝類，檢出水平最高達到288cfu/g。

圖3 大腸菌群/大腸桿菌檢出按月份分析比較Fig.3 Analysis and comparison of coliform/E.coli detection according to the month

2.4 三種貝類半年內大腸菌群/大腸桿菌檢出分析比較

通過分析比較從2012年10月到2013年3月半年內三種貝類中大腸菌群/大腸桿菌檢出平均水平及檢出率，發現牡蠣中大腸菌群和大腸桿菌檢出率是三種樣品中最低的;毛蚶中大腸菌群和大腸桿菌檢出平均水平及檢出率在三種貝類中均為最高;海虹中大腸菌群和大腸桿菌平均檢出水平比其余兩種貝類低，但其檢出率卻相對較高（見表3）。上述結果提示，牡蠣相對于毛蚶和海虹而言不易染菌，一旦感染，則檢出水平較高;毛蚶在三種樣品中最易染菌，而且檢出水平很高;海虹相對于其它兩種貝類大腸菌群和大腸桿菌檢出水平最低。

表3 半年內大腸菌群/大腸桿菌檢出分析比較Table 3 Analysis and comparison of coliform/E.coli detection within half a year

3 結論與討論

大腸桿菌作為各種食品的糞源性污染細菌學指標，是國際上公認的衛生檢測指示菌。本研究采用3M PetrifilmTM測試紙片法，快速檢測青島市售三種常見雙殼貝類的大腸桿菌/大腸菌群水平，并用斯皮爾曼等級相關系數評價大腸菌群/大腸桿菌與當地氣溫變化的相關性。結果顯示，在我們檢測期內周平均氣溫相對較高的前幾周，大腸菌群/大腸桿菌的檢出水平也相對較高，隨著氣溫的降低，大腸菌群/大腸桿菌的檢出水平也隨之降低。研究結果表明，青島市售雙殼貝類中大腸菌群/大腸桿菌的檢出具有溫度依賴性，其檢出水平與當地氣溫變化呈一定的正相關關系，斯皮爾曼等級相關系數分別為ρ=0.481、ρ=0.712。本研究提示:在當地氣溫較高時，貝類受到大腸菌群和大腸桿菌污染情況比較嚴重，需對貝類產品的貯藏運輸及質量控制予以高度重視。

控制環境溫度以延長貝類產品的貨架期，進行有效的保活保鮮，是滿足人類的需求以及控制食品安全的必要條件，也是將其打入海外市場的關鍵所在。浙江省采用海水激冷、冷藏倉空氣冷卻、噴霧加濕、蓄冷保濕等先進的低溫保鮮技術，而達到無冰保鮮，具有廣闊的應用前景［10］，泥蚶經處理后，細菌繁殖、生長代謝速度變慢，菌落總數也處于較低狀態，可以維持較長的貨架期。高捷［11］對毛蚶的保鮮技術進行研究，采用生物保鮮劑，考察不同溫度對毛蚶保鮮效果的影響，結果表明:采用生物保鮮劑處理結合低溫貯藏能較好地保持毛蚶的品質和鮮度。因此，低溫環境可以控制細菌繁殖，避免儲藏運輸過程中貝類腐敗變質，延長貝類產品的貨架期。

蔡友［12］等曾對浙江、江蘇、福建和山東青島等地沿海貝類主要產區的微生物污染情況進行調查。調查結果和有關資料顯示，青島市近岸海水中大腸菌群超標率為26%，貝類體內大腸菌群超標率為90%;福建的大腸桿菌超標率也較高，而江蘇、浙江相對好一些。在調查中，青島的細菌總數一般在104～106之間，而浙江、福建、江蘇好得多，一般在104左右。國家和農業部已采取措施將貝類健康化養殖體系示范列入農業跨越計劃，福建、青島都相繼開展貝類凈化工程，有效去除貝類的泥沙、微生物和病毒等，在治理餐桌污染上取得了一定的成效。經過凈化，高效消滅貝類產品中的病原菌和各種病毒，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、甲肝病毒、流感病毒等。凈化后的貝類既保存了原有的美味和營養，又達到食用標準，甚至可以生吃［13］。

大量研究發現，潮汐、海水溫度、鹽度、流速、餌料的濃度和質量和貝類個體大小等都會影響貝類的攝食（濾水）速率［14］。溫度、鹽度、流速和餌料對貝類攝食速率的影響特征都呈單峰變化（即在最適的溫、鹽度和餌料供應條件下攝食率最大）;海洋貝類在低鹽度下會逐漸停止攝食并關閉貝殼以避免低滲對肌體的損害。貝類個體大小對攝食速率有顯著影響，用殼長或體重表述貝類個體大小對攝食速率的影響是可行的。此外，對不同環境的適應、遺傳特性，以及攝食器官的形態構造特點等也影響貝類的攝食行為。林元燒［15］等在實驗室條件下對廈門海域4種養殖貝類，僧帽牡蠣、菲律賓蛤仔、縊蟶和翡翠貽貝的濾水率進行研究，發現濾水率大小順序依次為僧帽牡蠣、縊蟶、翡翠貽貝、菲律賓蛤仔。因此，海水的溫度等環境條件及貝類個體的自身差異都會影響其濾水率和攝食行為。本研究結果顯示:青島市售三種常見貝類中，牡蠣相對于毛蚶和海虹而言不易染菌，一旦感染，則檢出水平較高;毛蚶在三種樣品中最易染菌，而且檢出水平高;海虹相對于其它兩種貝類大腸菌群和大腸桿菌檢出水平最低。該結果可能與三種貝類濾水率和攝食行為不同有關。

本研究只收集了半年的貝類樣品，涉及到青島市三種常見貝類，要全面評價貝類中大腸桿菌、大腸菌群與當地氣溫變化的相關性，還需要對其它季節及更多貝類進行深入的研究。

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