響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶提取香椿葉總膳食纖維的工藝參數(shù)

劉 靜，李湘利，張啟美，魏海香，朱九濱，趙 敏

（濟寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東曲阜 273155）

膳食纖維是一類不被人體消化分解的多糖類碳水化合物和木質(zhì)素的總稱［1］。按溶解性不同可分為水溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和非水溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）兩類［2］。研究表明［3－4］，膳食纖維具有促進胃腸蠕動、增加糞便體積、縮短排便時間，預(yù)防便秘、結(jié)腸癌、心血管疾病等保健功能。營養(yǎng)學(xué)家稱膳食纖維為“第七大營養(yǎng)素”，現(xiàn)已作為食品工業(yè)的重要基料而被開發(fā)和應(yīng)用［5－6］。香椿（Toona sinensis（A.Juss.）Roem.）為楝科香椿屬落葉喬木，因其嫩芽有特殊香氣而得名［7］。谷雨前后，香椿葉開始纖維化，不宜食用而被摒棄［8－9］，如將其膳食纖維提取，可延長香椿產(chǎn)業(yè)鏈，增加效益［10］。目前國內(nèi)用于提取膳食纖維的原料主要以豆渣和麥麩為主［11］，而對香椿葉膳食纖維的研究較少［10］。為此，本實驗以香椿葉為試材，對復(fù)合酶提取香椿葉總膳食纖維（total dietary fiber，TDF）的工藝進行了系統(tǒng)研究，以期為香椿葉的綜合利用及功能性食品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香椿葉 2012年9月采自濟寧學(xué)院教職工生活區(qū);α－淀粉酶（5000U/g） 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;纖維素酶（10萬U/g） 湖州米純生物科技有限公司;中性蛋白酶（40萬U/g） 南寧龐博生物工程公司;無水乙醇，氫氧化鈉等 分析純。

2H－25C多功能食品加工機 澳柯瑪小家電有限公司;FCD2000鼓風(fēng)干燥箱 上海瑯玕實驗設(shè)備有限公司;SZF－06C粗脂肪測定儀 浙江托普儀器有限公司;TD6低速離心機 長沙英泰儀器有限公司;ZKH2000快速灰化爐 鶴壁市智勝科技有限公司;pHS－3C酸度計 上海宇隆儀器有限公司;HH－S24S數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海躍進醫(yī)療器械廠;FA2004N電子天平 上海精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 香椿老葉經(jīng)60℃烘干后，粉碎過40目篩得香椿葉粉。準確稱取一定質(zhì)量的香椿葉粉，按料水比1∶15加水，調(diào)節(jié)pH和溫度經(jīng)一定量的復(fù)合酶酶解后，煮沸10min滅酶，調(diào)整pH6.0，于60℃水浴中加入中性蛋白酶酶解30min后煮沸滅酶10min，以無水乙醇沉淀1h，4000r/min離心20min，所得沉淀于105℃烘箱中干燥即得產(chǎn)品TDF。

1.2.2 復(fù)合酶提取香椿葉TDF影響因素的研究 復(fù)合酶添加量的選擇:香椿葉粉在酶解pH6.0、酶解溫度65℃、酶解時間2.5h條件下，改變添加復(fù)合酶量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）進行酶解提取，以TDF提取率為指標確定酶添加量，復(fù)合酶（纖維維素酶與淀粉酶）的比例經(jīng)預(yù)實驗確定為1∶1。酶解時間的選擇:香椿葉粉在添加0.5%的復(fù)合酶，酶解pH6.0、酶解溫度65℃條件下，改變酶解時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h）進行提取，以 TDF 提取率為指標確定酶解時間。酶解溫度的選擇:香椿葉粉在添加0.5%的復(fù)合酶，pH6.0，酶解2.0h條件下，改變酶解溫度（45、50、55、60、65℃）進行提取，以 TDF 提取率為指標確定酶解溫度。酶解pH的選擇:香椿葉粉在添加0.5%的復(fù)合酶，酶解溫度60℃下酶解2.0h，改變酶解 pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）進行提取，以 TDF 提取率為指標確定酶解pH。TDF提取率的計算公式為:

1.2.3 提取工藝條件的優(yōu)化 結(jié)合單因素實驗結(jié)果，根據(jù)Box－Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，以復(fù)合酶添加量、酶解時間、酶解溫度、酶解pH為變量分別以 X1、X2、X3、X4表示，以香椿葉 TDF 提取率 Y 為響應(yīng)值，以－1、0、1分別代表變量的水平，實驗因素與水平見表1，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化復(fù)合酶提取TDF的工藝參數(shù)。

表1 Box－Behnken中心組合設(shè)計因素及水平表Table 1 Factors and levels of Box－behnken design

1.2.4 分析測試方法 水分，直接干燥法（GB5009.3－2010）;蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍染色法［12］;灰分，直接灰化法（GB5009.4－2010）;脂肪，索氏抽提法（GB/T5009.6－2003）;淀粉，酸水解法（GB/T5009.9－2008）;產(chǎn)品膳食纖維，酶重量法（AOAC991.43）;持水力和膨脹力，參照文獻［13］的方法。

1.3 結(jié)果統(tǒng)計方法

應(yīng)用 Design－Expert 8.0.7軟件、Microsoft Excel 2003進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 復(fù)合酶添加量對香椿葉TDF提取率的影響 由圖1可知，香椿粉樣液添加復(fù)合酶后，在pH6.0、65℃酶解2.5h，香椿葉TDF提取率隨酶添加量的增加，呈鐘形變化;尤以加酶量0.5%時，TDF提取率最高，可達73.02%（p＜0.05）;加酶量高于0.5%時，TDF提取率反而下降。這是因為用酶量較低時，IDF降解不徹底;但用酶量過高時，SDF被降解為低分子量多糖、低聚糖或單糖，而無法被乙醇沉淀，導(dǎo)致TDF提取率下降［14］。因此，復(fù)合酶添加量以0.5%為宜。

圖1 酶添加量對TDF提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme added on the yield of TDF

2.1.2 酶解時間對香椿葉TDF提取率的影響 由圖2可知，香椿粉樣液添加0.5%的復(fù)合酶，在pH6.0、65℃下酶解，隨酶解時間延長，香椿葉TDF提取率逐漸升高。酶解2.0h提取率最高可達73.41%（p＜0.05）;酶解2.0h以上，TDF提取率反而下降。因為酶解時間較短，原料中淀粉水解不完全，而酶解較長時間，半纖維素被水解為非膳食纖維，導(dǎo)致TDF提取率下降［15］。可見，酶解時間選擇2.0h較合適。

圖2 酶解時間對TDF提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the yield of TDF

2.1.3 酶解溫度對香椿葉TDF提取率的影響 由圖3可知，香椿粉樣液添加0.5%的復(fù)合酶，在pH6.0下酶解2.0h，隨酶解溫度升高，香椿葉TDF提取率升高;60℃時，TDF提取率最高達73.32%（p＜0.05），溫度高于60℃時，TDF提取率反而下降。酶在最適溫度下有最大酶活，偏離最適溫度，酶活受到抑制［16］。為此，酶解溫度以60℃較適宜。

2.1.4 酶解pH對香椿葉TDF提取率的影響 由圖4可知，香椿粉樣液添加0.5%的復(fù)合酶，在60℃下酶解2.0h，隨 pH的升高，香椿葉 TDF提取率升高;pH6.0時TDF提取率最高為73.27%（p＜0.05）;pH進一步升高，TDF提取率逐漸下降。這可能與pH接近6.0時，復(fù)合酶的活性較強有關(guān)。故選擇酶解pH6.0。

2.2 復(fù)合酶提取香椿葉TDF的響應(yīng)面優(yōu)化

圖3 酶解溫度對TDF提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the yield of TDF

圖4 酶解pH對TDF提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis pH on the yield of TDF

2.2.1 模型的建立與顯著性分析 選取復(fù)合酶添加量（X1）、酶解時間（X2）、酶解溫度（X3）、酶解 pH（X4）四個因素，以香椿葉TDF提取率（Y）為響應(yīng)值進行中心組合設(shè)計，實驗設(shè)計方案見表2，實驗1～24是析因?qū)嶒灒瑢嶒?5～29是中心實驗。29個實驗點分為析因和零點，其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點;零點為區(qū)域的中心點，零點實驗重復(fù)5次，用以估計實驗誤差。

對表2的結(jié)果進行多元回歸擬合和方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，模型F值為47.57（p＜0.01），說明所得回歸模型極顯著，而失擬項差異不顯著（p=0.2314＞0.05）。模型確定系數(shù)R2=0.98，調(diào)整確定系數(shù)=0.96，故模型擬合度較好，可用于預(yù)測TDF的實際提取率。對回歸方程系數(shù)進行顯著性檢驗的結(jié)果表明，一次項（X1、X2、X3、X4）與二次項（X12、）對TDF提取率影響極顯著（p＜0.01），交互項 X2X3影響顯著（p＜0.05），交互項 X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4影響不顯著（p＞0.05）;去除不顯著交互項，得到TDF提取率對各因素的回歸方程:

2.2.2 響應(yīng)面分析 利用Design Expert軟件得到二次回歸方程的響應(yīng)面，酶解溫度和酶解時間對TDF提取率的影響見圖5。

由圖5可知，在因素所考察的范圍內(nèi)，酶解時間不變時，隨酶解溫度升高，TDF提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢;溫度恒定時，隨酶解時間的延長，也表現(xiàn)為相同的變化趨勢。說明酶解時間與酶解溫度間存在明顯的交互作用，這與回歸方程中X2X3項系數(shù)為正相關(guān)。

表2 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果Table 2 Experiment design and results of response surface methodology

圖5 酶解溫度與酶解時間交互影響TDF提取率的響應(yīng)面Fig.5 Response surface for reciprocal effect of enzymolysis temperature and time on the yield of TDF

2.2.3 最優(yōu)酶解條件的確定和驗證 在所選實驗因素范圍內(nèi)，利用Design Expert軟件，得到復(fù)合酶法提取TDF的最優(yōu)條件:酶添加量0.54%、酶解pH6.11、酶解時間2.1h、酶解溫度60.89℃。考慮到實際操作的可行性，將TDF提取條件調(diào)整為加酶量0.5%、pH6.1、酶解2.0h、酶解溫度61℃。此條件的驗證性實驗結(jié)果表明，香椿葉TDF提取率為74.01%，與模型預(yù)測值74.04%基本相符。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis for the built regression model

表4 樣品及產(chǎn)品主要成分（%）Table 4 The main composition of sample and product（%）

2.3 產(chǎn)品TDF成分分析

由表4可知，所得產(chǎn)品中TDF含量為72.49%，其中SDF為6.53%，IDF為65.96%，均高于樣品中的含量;除灰分外，各種雜質(zhì)成分含量較低，說明除雜效果較好。

2.4 產(chǎn)品TDF功能性質(zhì)分析

由表5可知，所得產(chǎn)品TDF的持水力為6.50g/g，膨脹力為4.50mL/g，高于西方國家常用標準麩皮纖維的相應(yīng)值4.0g/g和4.0mL/g［17］，故本實驗所得TDF功能特性較好。

表5 持水力和膨脹性的測定結(jié)果Table 5 The results of holding water capacity and swelling property

3 結(jié)論

以纖維素酶和淀粉酶1∶1為復(fù)合酶，對香椿葉TDF進行提取，采用單因素實驗和采用Box－Behnken中心組合實驗設(shè)計響應(yīng)面法建立了復(fù)合酶添加量、酶解時間、酶解溫度、酶解pH四個因素對響應(yīng)值（香椿葉TDF提取率）相互作用的數(shù)學(xué)模型:Y=73.8+0.64X1+0.54X2+0.48X3+0.61X4+0.32X2X3－1.35X12－1.48X22－1.52X32－1.39X42。利用響應(yīng)面法對酶解工藝進行了優(yōu)化，所得 TDF提取條件為:酶添加量0.5%，酶解時間2.0h，酶解溫度61℃，酶解pH6.1，此條件下，香椿葉TDF提取率為74.01%。香椿葉TDF的理化性能較好，持水力為 6.50g/g，膨脹力為4.50mL/g。

［1］Tanaka M，Takamizu A，Hoshino M，et al.Extraction of dietary fiber from Citrus junos peel with subcritical water.［J］.Food and Bioproducts Processing，2012，90（2）:180－186.

［2］劉煥云，李慧荔，趙紅，等.燕麥麩中水溶性膳食纖維提取工藝優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)機械學(xué)報，2008，39（7）:103－106.

［3］Brownlee Iain A.The physiological roles of dietary fiber［J］.Food Hydrocolloids，2011，25（2）:238－250.

［4］郭亞姿，木泰華.甘薯膳食纖維物化及功能特性的研究［J］.食品科技，2010，35（9）:65－69.

［5］Valeria S E，Jose V G，Carmen R，et al.Influence of the addition of dietary fiber on the drying curves and microstructure of a dry fermented sausage（Sobrassada） ［J］.Drying technology，2012，30（2）:146－153.

［6］McCleary B V，DeVries J W，Rader J I，et al.Determination of insoluble，soluble，and total dietary fiber by enzymatic－gravimetric method and liquid chromatography:collaborative study［J］.Journal of AOAC International，2012，95（3）:824－844.

［7］Yu W J，Chang CC，Kuo T F，et al.Toona sinensisRoem leaf extracts improve antioxidant activity in the liver of rats under oxidative stress［J］.Food and Chemical Toxicology，2012，50（6）:1860－1865.

［8］王昌祿，江慎華，陳志強，等.香椿葉中活性物質(zhì)提取及其抗氧化活性的研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2007，23（10）:229－234.

［9］何丹.8個種源香椿的營養(yǎng)動態(tài)變化分析［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［10］劉靜，李湘利，馬義紅，等.水提法制備香椿葉水溶性膳食纖維工藝的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)，2013，34（5）:108－110.

［11］吳暉，侯萍，李曉鳳，等.不同原料中膳食纖維的提取及其特性研究進展［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24（1）:91－95.

［12］陳鈞輝，李俊，張冬梅，等.生物化學(xué)實驗［M］.北京:科學(xué)出版社，2008.

［13］ Rupérez P，Saura － Calixto F.Dietary fiber and physicochemical properties of edible Spanish seaweeds［J］.European Food Research and Technology，2001，212:349－354.

［14］牟建樓，王頡，孫劍鋒.響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取蘋果渣中水溶性膳食纖維［J］.食品科學(xué)，2012，33（8）:95－98.

［15］謝顯華，李國基.響應(yīng)面法研究脫脂豆粕渣膳食纖維提取工藝［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（2）:220－223.

［16］景言，遲玉杰.豆渣可溶性膳食纖維酶法制備工藝及其品質(zhì)分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（8）:68－72.

［17］毛慧君，文良娟，李英軍，等.發(fā)酵法從西番蓮果渣中制備膳食纖維的研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（3）:193－197.