繅絲蠶蛹蛋白酶法水解條件優(yōu)化

鐘雨珅，羅金鳳，黃先智 ，丁曉雯

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715;2.西南大學蠶學與系統(tǒng)生物學研究所，重慶 400715）

我國是世界最大的蠶繭生產國，年產鮮繭60余萬噸［1］。蠶蛹是蠶繭繅絲后的主要副產物，蛋白質含量占干蠶蛹質量的45%～55%［2］。蠶蛹蛋白含有18種氨基酸，其中8種人體必需氨基酸的含量占氨基酸總量的40%以上，高于WHO/FAO提出的參考蛋白模式，且比例適當，被證實為一種優(yōu)質、豐富的蛋白源［3－4］。在繅絲過程中，干蛹產量與繭絲量之比約為0.8∶1，即我國每年要產出12萬噸以上的繅絲蠶蛹［5］。由于繅絲蠶蛹一般經過了高溫和強堿等理化因素的作用，其感官、理化性質發(fā)生了劣變，目前主要用作動物飼料，在一定程度上降低了蠶蛹資源的附加值，也間接暴露出我國蠶桑產業(yè)的產品結構單一等問題。因此，如何更好地開發(fā)利用繅絲蠶蛹，提高其附加值成為了推動我國蠶桑產業(yè)發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)之一。

隨著生物技術的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)一些分子質量介于蛋白質和氨基酸的多肽具有極強的生物活性，如抗菌、增強免疫、抗氧化、降血壓、降膽固醇、礦物結合、抗血栓、促生長、抑制腫瘤轉移等作用［6－7］。這些生理功能是原蛋白所不具備或不可比擬的。通過酶解是制備生物活性肽的重要手段，同時酶解能夠改善繅絲蠶蛹劣變的感官品質，這為繅絲蠶蛹蛋白的開發(fā)利用提供了新途徑。

本文以繅絲蠶蛹蛋白為原料，通過多種酶單獨或組合對其進行水解，研究獲得最大水解度的酶解條件，以期為繅絲蠶蛹蛋白的深度開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

繅絲蠶蛹 由重慶合川太和絲廠提供;繅絲蠶蛹蛋白 自制，蛋白質含量77.31%;胃蛋白酶（酶活20萬U/g）、胰蛋白酶（酶活20萬U/g）Solarbio公司;中性蛋白酶（酶活10萬U/g）、堿性蛋白酶（酶活20萬U/g）、蠶蛹蛋白水解專用酶（酶活30萬U/g）

南寧東恒華道生物科技有限公司;木瓜蛋白酶（酶活80萬U/g）、風味酶（酶活3萬U/g）、胰酶（酶活4000U/g） 廣西南寧龐博生物工程有限公司;其他常用試劑 均為分析純。

pHs－3C酸度計 上海三信儀表廠;5810型臺式高速離心機 Eppendorf中國有限公司;UV－2405分光光度計 日本島津（中國）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 繅絲蠶蛹蛋白酶解用酶的篩選 以水解度為指標來確定酶解繅絲蠶蛹蛋白的較佳酶。

將脫脂繅絲蠶蛹蛋白粉過60目篩，用8種蛋白酶水解，探討不同水解時間對水解度的影響。水解條件是生產廠商提供的各酶的最適水解條件，在恒溫水浴中維持溫度恒定，以1mol/L的HCl或NaOH維持pH恒定，水解條件如表1所示。

表1 單酶水解繅絲蠶蛹蛋白的水解條件Table 1 Hydrolysis conditions on silkworm pupa protein by single enzyme

分別酶解6h，然后于沸水浴中加熱10min使酶滅活，流動水冷卻酶解液，用純水補足水解過程中蒸發(fā)的水分，4000r/min離心15min，收集上清液測定水解度。水解度計算公式［8］如下:

采用凱氏定氮法測定酶解液的總氮量［8］，雙指示劑甲醛滴定法測定氨基酸態(tài)氮含量［9］。

1.2.2 繅絲蠶蛹蛋白酶解條件的優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實驗優(yōu)化酶解條件 在研究一項實驗條件時，固定其他實驗條件不變，考察待研究因素變化對水解度的影響。

pH對水解度的影響:底物濃度5%，溫度55℃，加酶量2%，采用1mol/L HCl或1mol/L NaOH調節(jié)水解體系的pH，設定pH 分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，酶解4h后滅酶離心，測酶解液總氮和氨基酸態(tài)氮含量，計算水解度。

底物濃度對水解度的影響:加酶量2%，溫度為55℃，pH8.0，底物濃度分別為 1%、3%、5%、10%、15%、20%、25%，并按上述方法計算水解度。

加酶量對水解度的影響:底物濃度5%，pH8.0，溫度55℃，加酶量分別為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%，并按上述方法計算水解度。

溫度對水解度的影響:底物濃度5%，加酶量2%，pH8.0，設溫度分別為 45、50、55、60、65℃，并按上述方法計算水解度。

1.2.2.2 響應曲面法優(yōu)化酶解條件的實驗 在單因素實驗最佳水平左右的小范圍內，以水解度為響應值（Y），用響應面法進一步優(yōu)化酶解條件。根據中心組合實驗設計原理，采用四因素五水平的響應面分析方法設計實驗，分析因素與設計見表2。

表2 響應面分析因素與水平Table 2 Variables and levels in central composite design

1.2.3 數(shù)據處理方式 每項實驗重復3次以上，實驗結果取平均值，采用Excel 2007、SPSS17.0進行數(shù)據分析，Excel 2007軟件做圖。

2 結果與分析

2.1 繅絲蠶蛹蛋白酶解用酶的篩選

酶解蛋白質所得多肽的生理活性與蛋白酶的種類和水解度［10］有密切關系。以水解度為指標，對實驗用的8種蛋白酶是否適于繅絲蠶蛹蛋白的水解進行探討，結果如圖1所示。

圖1 繅絲蠶蛹蛋白酶解后水解度的比較Fig.1 Comparison of the silkworm pupa protein hydrolysis degree

由圖1可見，繅絲蠶蛹蛋白的酶解從開始至4h內，水解度的增加相對較快且達到較高的水平，并且還需綜合考慮蛋白質品質和投入產出比的因素，因而后面的實驗選用4h作為酶解時間。

不同蛋白酶水解繅絲蠶蛹蛋白4h時所得水解度的結果如圖2所示。

對圖2進行顯著性分析的結果表明，在加酶量、底物濃度、酶解時間一定時，E7（蠶蛹蛋白水解專用酶）對繅絲蠶蛹蛋白的水解較其他蛋白酶具有顯著優(yōu)勢。因此，以下將通過單因素實驗和響應面法對E7水解繅絲蠶蛹蛋白的條件進行優(yōu)化。

2.2 單因素實驗對E7酶解繅絲蠶蛹蛋白條件的優(yōu)化

2.2.1 pH對繅絲蠶蛹蛋白水解度的影響 酶的活性部位由結合部位和催化部位組成，結合部位和催化部位的基團對反應體系的pH變化比較敏感［11－13］。用蠶蛹蛋白水解專用酶水解繅絲蠶蛹蛋白，pH對水解度的影響如圖3所示。

由圖3可知，當pH8.0時，底物濃度5%，加酶量2%，溫度55℃時，E7對繅絲蠶蛹蛋白的水解度達到最大，為21.15%。這說明酶催化體系中作為底物的蠶蛹蛋白在pH8.0時表現(xiàn)出較好的解離狀態(tài)。因此，選取pH8.0作為其較佳的酶解pH。

圖2 繅絲蠶蛹蛋白酶解4h時水解度的比較Fig.2 Comparison of the silkworm pupa protein hydrolysis degree after 4hours of enzymolysis

圖3 pH對繅絲蠶蛹蛋白水解度的影響Fig.3 The effect of pH on silkworm pupa protein hydrolysis degree

2.2.2 底物濃度對繅絲蠶蛹蛋白水解度的影響 適當?shù)牡孜餄舛扔欣诜磻蛏晌锓较蜻M行。用蠶蛹蛋白水解專用酶水解繅絲蠶蛹蛋白，底物濃度對水解度的影響如圖4所示。

圖4 底物濃度對蠶蛹蛋白水解度的影響Fig.4 The effect of substrate concentration on silkworm pupa protein hydrolysis degree

由圖4可知，當?shù)孜餄舛葹?%，pH8.0，加酶量2%，溫度55℃時其水解度達到最大值，為21.15%。這說明當?shù)孜餄舛鹊陀?%時，氨基酸得率少，水解效率低;當?shù)孜餄舛雀哂?%時，酶的穩(wěn)定性下降，且酶活力也受到抑制。因此，選取5%作為較佳的底物濃度。

2.2.3 加酶量對繅絲蠶蛹蛋白水解度的影響 在底物濃度一定時，底物的轉化率取決于酶濃度，酶濃度越大，酶與蛋白質接觸的幾率增加，底物轉化的能力也就相應增加［14］。酶解繅絲蠶蛹蛋白的酶用量對水解度的影響如圖5所示。

圖5 加酶量對繅絲蠶蛹蛋白水解度的影響Fig.5 The effect of additive amount of protease on silkworm pupa protein hydrolysis degree

由圖5可見，在pH8.0，底物濃度5%，溫度55℃時，在實驗的加酶量范圍內，當加酶量在2%以內時，水解度的增加很快;當加酶量超過2%后，水解度的增加趨緩。同時還需綜合考慮酶的成本和目標水解度的要求，因此選取2%作為較適宜的加酶量。

2.2.4 溫度對繅絲蠶蛹蛋白水解度的影響 酶催化反應存在著最適溫度。在最適溫度以下，隨著溫度的升高，反應速度越快。如果超過酶的最適溫度，將導致酶變性，使酶活性減弱甚至喪失［15］。繅絲蠶蛹蛋白酶解溫度對水解度的影響如圖6所示。

圖6 溫度對繅絲蠶蛹蛋白水解度的影響Fig.6 The effect of temperature on silkworm pupa protein hydrolysis degree

由圖6可知，在 pH8.0，底物濃度5%，加酶量2%，當溫度達到55℃時，水解度達到最大值，為21.15%。這說明55℃為酶的最適溫度，當超過55℃時，維持酶分子結構的次級鍵解體，使得酶活性減弱甚至喪失。因此，選取55℃作為酶解的適宜溫度。

通過單因素實驗，得到蠶蛹蛋白水解專用酶酶解繅絲蠶蛹蛋白的最優(yōu)條件是pH8.0，底物濃度5%，加酶量2%，溫度55℃。

由于單因素優(yōu)化方法是在其他因素不變的條件下，每次優(yōu)化一個因素而得到的，忽略各因素間的交互作用。為了得到最優(yōu)的酶解條件，在單因素實驗的基礎上，應用響應面法優(yōu)化蠶蛹蛋白水解專用酶酶解繅絲蠶蛹蛋白的條件。

2.3 響應面法優(yōu)化E7水解繅絲蠶蛹蛋白的條件

E7酶解條件的中心組合設計得到的實驗結果見表3。

表3 響應面分析方案及實驗結果Table 3 Scheme and results of response surface analysis

利用Design Expert 7.0軟件對實驗結果進行響應面分析，得出回歸模型參數(shù)的方差分析見表4。

對響應值與各因素進行回歸擬合后，得到的回歸方程如下:

回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性由F值來判斷，概率p（F＞Fa）值越小，則相應變量的顯著程度越高。模型p值小于0.01，表示模型高度顯著，失擬項p=0.0631（＞0.05），影響不顯著，說明未知因素對實驗結果干擾小。R2=0.9907，說明模型擬合程度良好，實驗誤差小。因此，回歸方程可以較好的描述各因素與響應值之間的真實關系。

表4 回歸方程系數(shù)方差分析Table 4 The variance analysis of regression equation

pH和加酶量的p值均小于0.01，說明其對水解度的影響極顯著;底物濃度和溫度的p值大于0.05，說明其對水解度影響不顯著;各交互項的p值均大于0.05，說明各因素間的交互作用對水解度的影響不顯著，因此后面沒有列出各因素的交互作用圖;pH和加酶量的二次項對水解度的影響也是極顯著的，而底物濃度和溫度的二次項不顯著。

由響應面優(yōu)化結果可知，在水解時間為4h時，蠶蛹蛋白水解專用酶水解繅絲蠶蛹蛋白的最佳條件為:底物濃度為 7%，溫度 53.09℃，pH7.2，加酶量3%，水解度預測值為22.09%。為了便于對實驗條件進行控制，驗證實驗時將溫度設為53℃，底物濃度為7%，pH7.2，加酶量為 3%，得到的實際水解度為21.44%，與預測值無顯著差異（p＜0.05）。證明實驗設計與分析方法是準確可靠的。

驗證實驗得到的最優(yōu)水解度與單因素實驗的結果（水解度21.15%）無顯著差異（p＜0.05），這是由于在實驗的范圍內底物濃度和溫度對水解度的影響不顯著，各因素交互作用的對水解度的影響也不顯著，說明單因素實驗已得到了較好結果。在pH7.2～8.0，底物濃度 5%～7%，加酶量 2%～3%，溫度53～55℃的范圍內均可得到較高的水解度。

3 結論

單酶水解時，8種蛋白酶中蠶蛹蛋白水解專用酶對繅絲蠶蛹蛋白的水解度最高，達到20.98%。因而蠶蛹蛋白水解專用酶最適于水解繅絲蠶蛹蛋白。

在水解時間為4h的條件下，通過單因素實驗和響應面法優(yōu)化后確定其最佳酶解參數(shù)為:pH7.2，底物濃度7%，加酶量3%，溫度53℃，其水解度達到21.44%。

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