UPLC-MS/MS定性分析黑米中花青苷類物質(zhì)

韓 豪，李新生，江 海，石紹福，馬嬌燕，楊智勇，劉水英，王 昕

（1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000;2.陜西省黑色有機(jī)食品工程技術(shù)研究中心，陜西漢中 723000;3.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西漢中 723000;4.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，陜西漢中 723000）

花青苷類物質(zhì)又名花色苷，是在自然狀態(tài)下花青素與各種單糖結(jié)合而成的黃酮多酚類化合物。常見(jiàn)的花青苷類物質(zhì)主要有天竺葵素（花葵素）、矢車菊素、飛燕草素（翠雀素）、芍藥素、矮牽牛素和錦葵素六大類［1－6］。黑米的種皮中富含花青苷類物質(zhì)，具有清除自由基、抗氧化、抑制酶活性、保護(hù)血管、抗炎癥和抑制腫瘤等多種功效［7－9］。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黑米花青苷的報(bào)道多集中在花青苷的提取和穩(wěn)定性研究上，而對(duì)黑米花青苷單一組分分析的研究較少，在之前的研究中僅對(duì)黑米中的矢車菊素－3－葡萄糖苷、矢車菊素－3－蕓香糖苷和芍藥素－3－葡萄糖苷、芍藥素－3－阿拉伯糖苷和錦葵素－3－半乳糖苷進(jìn)行了準(zhǔn)確定性［7，10］。因此，本研究采用超高效液相色譜－三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC－MS/MS），建立矢車菊素類、芍藥素類、天竺葵素類和錦葵素類這四類共13種花青苷類物質(zhì)的定性方法，并對(duì)黑米（黑帥）中這13種花青苷類物質(zhì)進(jìn)行了定性分析。從而為黑米花青苷類化合物單一組分的系統(tǒng)分析、分離純化和藥理活性研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑米樣品 黑帥，由陜西省水稻研究所提供。

乙腈、甲醇 色譜純，霍尼韋爾公司;甲酸 色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;13種標(biāo)準(zhǔn)品 均購(gòu)置于sigma公司，含量均≥97%，分別為矢車菊素（Cy）、矢車菊素－3－葡萄糖苷（Cy－3－glc），矢車菊素－3－阿拉伯糖苷（Cy－3－ara），矢車菊素－3－蕓香糖苷（Cy－3－rut），矢車菊素－3－槐糖苷（Cy－3－soph）;天竺葵素－3－葡萄糖苷（Pg－3－glc）;錦葵素－3－葡萄糖苷（Mv－3－glc）、錦葵素－3－半乳糖苷（Mv－3－gal）;芍藥素（Pn）、芍藥素－3，5－雙葡萄糖苷（Pn－3，5－diglc）、芍藥素－3－半乳糖苷（Pn－3－gal）、芍藥素－3－葡萄糖苷（Pn－3－glc）、芍藥素－3－阿拉伯糖苷（Pn－3－ara）。

ACQUITY TQD超高效液相色譜－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)waters公司;RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DZF6050真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;LC－800離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司。

1.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取黑米（黑帥）1.0g，加入100mL石油醚索氏提取兩次，提取時(shí)間均為3h。樣品揮干后，加入100mL乙酸乙酯，置于60℃水浴中至乙酸乙酯揮干，重復(fù)操作一次。然后加入6%的甲酸水溶液50mL，在50℃下回流提取6h，重復(fù)操作一次，合并上清液，用6%甲酸水溶液定容至100mL，再用0.2μm的針頭過(guò)濾器過(guò)濾，于超高效液相－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3 質(zhì)譜方法的建立

離子源:電噴霧離子源（ESI）;檢測(cè)模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);掃描方式:正離子掃描;脫溶劑氣流量:800L/h;錐孔氣流量:50L/h;毛細(xì)管電壓:3kV;離子源溫度:110℃;脫溶劑氣溫度:400℃。

1.4 色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1mm×50mm，1.7μm）;流速 0.3mL/min;柱溫 40℃;進(jìn)樣量:10μL。流動(dòng)相A為乙腈，B為0.6%甲酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫參數(shù)如表1所示。

表1 超高效液相色譜條件Table 1 Gradient elution procedure for UPLC seperation

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

將表2中的13種花青苷類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品用6%的甲酸水溶液溶解后，配制成500～1000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后以直接進(jìn)樣方式分別注入離子源中，在ESI正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，得到每種花青苷類物質(zhì)的分子離子峰，以每種花青苷類物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子峰為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，接著采集全掃描的二級(jí)質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，對(duì)每種花青苷類物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)如錐孔電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，最后每種花青苷類物質(zhì)的定性離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度比例達(dá)到最大時(shí)為最佳，得到以定性離子、錐孔電壓和碰撞電壓的相關(guān)數(shù)據(jù)，如表2所示。

表2 花青苷標(biāo)準(zhǔn)品最佳錐孔電壓和碰撞電壓Table 2 The best cone voltages and collision voltages of anthocyanins standard solution

花青苷類物質(zhì)是由花青苷苷元與一個(gè)或多個(gè)糖分子通過(guò)糖苷鍵結(jié)合的化合物，其種類繁多，存在多個(gè)同分異構(gòu)體，且極性相近，因此純化和檢測(cè)難度較大［2］。目前國(guó)內(nèi)外采用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)花青苷進(jìn)行定性分析時(shí)，多采用在同一錐孔和碰撞電壓下檢測(cè)化合物的特征離子對(duì)，并參考該化合物紫外最大吸收波長(zhǎng)［10－11］，但是從表 2 中可見(jiàn)，花青苷類化合物最佳的錐孔和碰撞電壓差異顯著，用同一電壓進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碰撞時(shí)，部分化合物會(huì)因電壓過(guò)大，使得特征子離子被電離成碎片離子，或者因電壓過(guò)小，無(wú)法電離，從而無(wú)法檢測(cè)出特征子離子。本實(shí)驗(yàn)采用直接進(jìn)樣方式將標(biāo)準(zhǔn)溶液依次注入離子源中，對(duì)每種化合物的錐孔和碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，提高了樣品檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

在適當(dāng)?shù)腻F孔電壓和碰撞電壓下，花青苷的糖苷鍵首先斷裂，之后花青苷苷元C環(huán)開(kāi)環(huán)重排。矢車菊素類花青苷的糖苷鍵斷裂后會(huì)檢測(cè)到m/z 287的特征離子峰，即為矢車菊素類花青苷苷元，加大碰撞電壓，可得到m/z 136.9的特征碎片離子峰，即為原兒茶醛（3，4－二羥基苯甲醛）。例如，矢車菊素－3－葡萄糖苷在錐孔電壓為32V，碰撞電壓為22V時(shí)，矢車菊素－3－葡萄糖苷（m/z 449.1）的葡萄糖苷鍵斷裂，得到矢車菊素花青苷苷元（m/z 287）和葡萄糖（m/z 162），而葡萄糖不帶電荷在質(zhì)譜中無(wú)法檢測(cè)出;之后在錐孔電壓為32V，碰撞電壓為56V時(shí)，矢車菊素花青苷苷元（m/z 287）C環(huán)開(kāi)環(huán)重排，得到特征子離子為原兒茶醛（m/z 136.9），因此，矢車菊素－3－葡萄糖苷特征定性離子對(duì)應(yīng)為449.1/287和449.1/136.9，其結(jié)構(gòu)裂解圖和質(zhì)譜圖分別見(jiàn)圖1（A）所示。

芍藥素類花青苷的糖苷健斷裂后會(huì)檢測(cè)到m/z 301的特征離子峰，即為芍藥素類花青苷苷元;加大碰撞電壓，可得到m/z 150.9的特征碎片離子峰，即為香草醛（3－甲氧基－4－羥基苯甲醛）。以芍藥素－3－半乳糖苷（m/z 463）為例，芍藥素－3－半乳糖苷特征定性離子對(duì)應(yīng)為463/301和463/150.9，其結(jié)構(gòu)裂解圖和質(zhì)譜圖分別見(jiàn)圖1（B）所示。

錦葵素類花青苷的糖苷健斷裂后會(huì)檢測(cè)到m/z 331的特征離子峰，即為錦葵素類花青苷苷元;加大碰撞電壓，可得到m/z 180.9的特征碎片離子峰，即為丁香醛（3，5－二甲氧基－4羥基苯甲醛）。以錦葵素－3－葡萄糖苷（m/z 493）為例，錦葵素－3－葡萄糖苷特征定性離子對(duì)應(yīng)為493/331和493/180.9，其結(jié)構(gòu)裂解圖和質(zhì)譜圖分別見(jiàn)圖1（C）所示。

天竺葵素類花青苷的糖苷健斷裂后會(huì)檢測(cè)到m/z 271的特征離子峰，即為天竺葵素類花青苷苷元;加大碰撞電壓，可得到m/z 120.9的特征碎片離子峰，即為對(duì)羥基苯甲醛。以天竺葵素－3－葡萄糖（m/z 433）為例，天竺葵素－3－葡萄糖特征定性離子對(duì)應(yīng)為433/271和433/120.9，其結(jié)構(gòu)裂解圖和質(zhì)譜圖分別見(jiàn)圖1（D）所示。

圖1 花青苷質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)裂解圖Fig.1 Mass spectra and proposed fragmentation pathways of anthocyanins

2.2 黑米花青苷類化合物的定性分析

依據(jù)花青苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜參數(shù)，確定了對(duì)應(yīng)的定性離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞電壓，通過(guò)超高效液相色譜，確定花青苷類物質(zhì)的保留時(shí)間。通過(guò)定性離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞電壓和保留時(shí)間（允許保留時(shí)間偏離±0.05min），對(duì)黑米中花青苷類物質(zhì)的組分進(jìn)行定性分析。

2.2.1 黑米中矢車菊素類花青苷的定性分析 在MRM模式掃描下，通過(guò)超高效液相色譜柱進(jìn)行分離，矢車菊素類花青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間如表3所示，對(duì)黑米進(jìn)行檢測(cè)可得，黑米中含有矢車菊素－3－槐糖苷、矢車菊素－3－葡萄糖苷、矢車菊素－3－阿拉伯糖苷、矢車菊素－3－蕓香糖苷和矢車菊素，共5種矢車菊素類花青苷，如圖2所示。孔令瑤等［7］采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)與毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)對(duì)黑米色素進(jìn)行定性分析檢測(cè)出矢車菊素－3－葡萄糖苷，孫嫵娟等［12］采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)也檢測(cè)出矢車菊素－3－葡萄糖苷;Abdel－Aal等［10］在黑米中檢測(cè)出矢車菊素－3－葡萄糖苷、矢車菊素－3－蕓香糖苷和2個(gè)矢車菊素二糖苷（未準(zhǔn)確定性）。因此，矢車菊素－3－槐糖苷、矢車菊素－3－阿拉伯糖苷和矢車菊素這3個(gè)矢車菊素類花青苷在黑米花青苷研究中未見(jiàn)報(bào)道。

表3 矢車菊素類花青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間Table 3 Retention time of cyanidins standard

表4 芍藥素類花青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間Table 4 Retention time of peonidins standard

圖2 黑米中矢車菊素類花青苷總離子色譜圖Fig.2 Total ion current cyanidins of black rice

2.2.2 黑米中芍藥素類花青苷的定性分析 在MRM模式掃描下，通過(guò)超高效液相色譜柱進(jìn)行分離，芍藥素類花青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間如表4所示，對(duì)黑米進(jìn)行檢測(cè)可得，黑米中含有芍藥素－3，5－雙葡萄糖苷、芍藥素－3－半乳糖苷、芍藥素－3－葡萄糖苷、芍藥素－3－阿拉伯糖苷和芍藥素，共5種芍藥素類花青苷，如圖3所示。其中芍藥素－3－葡萄糖苷在黑米中已經(jīng)檢測(cè)出［7，10，12］，芍藥素－3，5－雙葡萄糖苷、芍藥素－3－半乳糖苷、芍藥素－3－阿拉伯糖苷和芍藥素這4種芍藥素類花青苷在黑米花青苷研究中未見(jiàn)報(bào)道。

2.2.3 黑米中錦葵素類花青苷的定性分析 在MRM模式掃描下，通過(guò)超高效液相色譜柱進(jìn)行分離，如圖4所示，錦葵素－3－半乳糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間為4.36min，錦葵素類－3－葡萄糖苷保留時(shí)間為4.61min，由這2個(gè)總離子色譜圖可見(jiàn)黑米中錦葵素類花青苷檢測(cè)出錦葵素－3－半乳糖苷和錦葵素類－3－葡萄糖苷。Sam等［13］在黑米中檢測(cè)出錦葵素類－3－葡萄糖苷，錦葵素－3－半乳糖苷在黑米花青苷研究中未見(jiàn)報(bào)道。

2.2.4 黑米中天竺葵素類花青苷的定性分析 在MRM模式掃描下，通過(guò)超高效液相色譜柱進(jìn)行分離，如圖5所示，天竺葵素類－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間為3.94min，由總離子色譜圖可見(jiàn)黑米中含有天竺葵素類－3－葡萄糖苷。天竺葵素類－3－葡萄糖苷在黑米花青苷研究中已有報(bào)道［13］。

3 結(jié)論

針對(duì)黑米中花青苷結(jié)構(gòu)復(fù)雜，液相色譜法無(wú)法對(duì)極性相近化合物進(jìn)行分離檢測(cè)等問(wèn)題，本研究采用超高效液相色譜－三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，并以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，建立了黑米中花青苷類化合物的檢測(cè)方法，該方法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效、選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)。

圖3 黑米中芍藥素類花青苷總離子色譜圖Fig.3 Total ion current peonidins of black rice

對(duì)黑米中花青苷類物質(zhì)進(jìn)行定性分析，結(jié)果檢測(cè)出黑米（黑帥）中的13種花青苷類物質(zhì)分別為矢車菊素－3－槐糖苷、矢車菊素－3－葡萄糖苷、矢車菊素－3－阿拉伯糖苷、矢車菊素－3－蕓香糖苷、矢車菊素、芍藥素－3，5－雙葡萄糖苷、芍藥素－3－半乳糖苷、芍藥素－3－葡萄糖苷、芍藥素－3－阿拉伯糖苷、芍藥素、錦葵素－3－半乳糖苷、錦葵素類－3－葡萄糖苷和天竺葵素類－3－葡萄糖苷。其中，矢車菊素類花青苷是黑米中主要花青苷，葡萄糖是黑米花青苷的主要糖配基，本研究首次檢測(cè)到黑米中含有矢車菊素－3－槐糖苷、矢車菊素－3－阿拉伯糖苷、矢車菊素、芍藥素－3，5－雙葡萄糖苷、芍藥素－3－半乳糖苷、芍藥素－3－阿拉伯糖苷、芍藥素和錦葵素類－3－半乳糖苷這8種花青苷。

圖4 黑米中錦葵素類花青苷總離子色譜圖Fig.4 Total ion current malvidins of black rice

圖5 黑米中天竺葵素－3－葡萄糖苷總離子色譜圖Fig.5 Total ion current Pg－3－glc of black rice

在此研究基礎(chǔ)上，今后可進(jìn)一步研究黑米不同品種中花青苷類物質(zhì)的準(zhǔn)確定性和定量分析，花青苷類化合物單一組分的分離純化、藥理活性研究和黑米中花青苷類物質(zhì)的代謝途徑等問(wèn)題。

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