凝膠層析和離子交換層析結(jié)合法純化重組降血壓肽VLPVPR

李 艷，孫海燕，周麗珍，劉 冬

（深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院深圳市發(fā)酵精制檢測系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518055）

VLPVPR（Val－Leu－Pro－Val－Pro－Arg）［1］是重組的6拷貝串聯(lián)肽，以融合蛋白GST－AHP形式通過構(gòu)建的基因工程菌E.coliBL21（pGEX－4T－2－AHP）大規(guī)模發(fā)酵，采用胰蛋白酶水解GST－AHP得到的血管緊張素酶抑制肽單體。VLPVPR通過抑制血管緊張素酶從而達(dá)到降血壓效果［2－6］。多肽類層析分離常用的方法包括:離子交換層析、凝膠過濾層析、HPLC、RP－HPLC、薄層色譜、毛細(xì)管電泳等。一般說來，單一分離純化操作技術(shù)難以獲得較好的分離純化效果，因此，多肽分離純化一般需要綜合考慮其分子量分布、帶電性質(zhì)以及分子極性大小等理化性質(zhì)，選用多種分離純化方法進(jìn)行多步純化，以達(dá)到最佳的分離效果。劉冬等［7］采用凝血酶酶解GST－AHP融合蛋白再結(jié)合親和層析和凝膠過濾對VLPVPR進(jìn)行分離，因?yàn)槟负陀H和層析劑價格昂貴而導(dǎo)致操作成本過高，從而阻礙了VLPVPR的產(chǎn)業(yè)化前景。李艷［8－9］等采用大孔吸附樹脂對VLPVPR進(jìn)行分離，純化后的純度僅為27.4%，達(dá)不到純化要求，大孔吸附樹脂對VLPVPR只能起到初步分離的作用。

凝膠層析［10－12］是按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。采用凝膠層析法脫鹽有操作簡便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽過程中不易變性等優(yōu)點(diǎn)。離子交換層析［13－14］是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)及臨床生化檢驗(yàn)中，主要用于分離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。

表1 離子交換劑的結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Structural parameters of ion exchanger

為了推進(jìn)VLPVPR在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，需提高VLPVPR的純度，本文擬探索凝膠過濾層析結(jié)合離子交換層析分離純化VLPVPR的可能性。具體擬用Sephadex G－10凝膠對VLPVPR溶液進(jìn)行脫鹽，在此基礎(chǔ)上，再用離子交換層析（SP Sepharose Fast Flow強(qiáng)陽離子交換劑或Q Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子交換劑）進(jìn)行進(jìn)一步的純化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

VLPVPR溶液 自制（構(gòu)建的基因工程菌E.coliBL21（pGEX－4T－2－AHP）大規(guī)模發(fā)酵，初步純化所得）;SP Sepharose Fast Flow強(qiáng)陽離子交換劑（具體參數(shù)見表1），Q Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子交換劑（具體參數(shù)見表1），Sephadex G－10凝膠 美國GE Healthcare公司;三羥甲基氨基甲烷（Tris） 美國Solarbio公司;2－環(huán)己氨基乙磺酸（CHES） 美國Alladin公司;三氟乙酸（TFA，色譜純） 日本東京化學(xué)工業(yè)株式會社;乙腈（CAN，色譜純） 天津協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司;VLPVPR標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于95%） 西安美聯(lián)多肽合成有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

高效液相色譜儀 LC－20AT 日本島津公司;層析柱（XK 16mm ×40cm，XK 16mm ×70cm） GE Healthcare公司;?KTA explorerTMGE Healthcare公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 采用 RP－HPLC法測定VLPVPR含量。具體方法如下:色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB－Cl8（250mm × 4.6mm，5μm）;流動相組成:A相為100%水+0.05%（v/v）TFA，B相為100%ACN+0.05%（v/v）TFA，A∶B=85∶15;流速1mL/min，進(jìn)樣體積20μL，柱溫35℃，檢測波長為199nm。

1.2.2 樣品（VLPVPR 溶液）的制備［15］利用已構(gòu)建的E.coliBL21工程菌進(jìn)行高密度發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心l0min，收集菌體。每克濕菌體懸于3mL 含 有 2mol/L EDTA 的 1 × PBS（0.01mol/L，pH7.4）緩沖液中，加溶菌酶至終濃度20000U/mL，室溫放置30min后超聲破碎30min，4℃ 12000r/min離心10min，取上清液進(jìn)行胰蛋白酶水解，酶解溫度為37℃，pH8.0，酶濃度為 90U/mL 樣品，酶解時間為4h，再 12000r/min離心 15min取上清液，過0.45μm 膜。

1.2.3 Sephadex G－10凝膠層析脫鹽實(shí)驗(yàn) 取適量Sephadex G－10凝膠用pH9.0的CHES緩沖液充分溶脹后，裝入色譜柱（XK 16mm×70cm）中，將樣品溶液以柱床體積的20%上樣，上樣速度1mL/min;上樣后以10mmol/L pH9.0的CHES緩沖液洗脫，洗脫流速為1mL/min，收集全排阻組分，RP－HPLC法測定收集液中VLPVPR含量。

1.2.4 SP Sepharose Fast Flow靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)備9支15mL試管，每管加入1mL SP Sepharose Fast Flow，根據(jù)SP Sepharose Fast Flow的性質(zhì)，分別加入10mL 0.01mol/L 不 同 pH（6.0 ～ 10.0）的緩沖 液平 衡 SP Sepharose Fast Flow。在實(shí)際工作中，一般根據(jù)不同的pH條件來決定采用何種緩沖體系，其中pH6.0～7.0 采用磷酸鹽緩沖液，pH7.5～8.5 采用 Tris－HCl緩沖液，pH9.0～10.0 采用 CHES 緩沖液。各試管中加入等量的VLPVPR標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為1000mg/L），分別于1/3、2/3、1、2 和 4h 吸取 0.5mL 吸附殘留液，RP－HPLC檢測VLPVPR的濃度，根據(jù)下面公式計(jì)算吸附率并繪制靜態(tài)吸附平衡曲線。

式中，C0:吸附前溶液中VLPVPR濃度（mg/L）;C1:吸附后溶液中VLPVPR濃度（mg/L）;X:樹脂對VLPVPR吸附率（%）。

1.2.5 SP Sepharose Fast Flow 動態(tài)分離實(shí)驗(yàn) 取適量經(jīng)過充分溶脹的SP Sepharose Fast Flow裝入色譜柱（XK 16mm ×24cm），用 10mmol/L pH7.5 的 Tris－HCl緩沖液平衡柱子后（檢測波長λ=199nm），上經(jīng)Sephadex G－10凝膠脫鹽后的VLPVPR樣品溶液，上樣流速為0.5mL/min，收集穿透液，RP－HPLC 法測定穿透液中降血壓肽含量，根據(jù)上面公式計(jì)算 SP Sepharose Fast Flow對VLPVPR的吸附率。

1.2.6 Q Sepharose Fast Flow動態(tài)分離實(shí)驗(yàn) 取適量充分溶脹的 Q Sepharose Fast Flow，用 10mmol/L pH9.0的CHES緩沖液平衡柱子后（檢測波長λ=199nm），上經(jīng)Sephadex G－10凝膠脫鹽后的VLPVPR樣品溶液，上樣流速為 1mL/min，收集穿透液，RP－HPLC法測定穿透液中降血壓肽含量，并計(jì)算穿透液中VLPVPR的純度及回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

VLPVPR標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。以VLPVPR濃度為橫坐標(biāo)，以液相相應(yīng)面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2）。

2.2 Sephadex G－10凝膠層析脫鹽實(shí)驗(yàn)

采用Sephadex G－10對樣品（VLPVPR溶液）脫鹽，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。收集1、2、3號峰，RPHPLC檢測發(fā)現(xiàn)VLPVPR集中在1號峰，其VLPVPR濃度為 85.4mg/L，脫鹽前為 113.0mg/L，回收率為94.8%，脫鹽率達(dá)到85.4%，脫鹽后 VLPVPR 溶液進(jìn)一步經(jīng)過離子交換層析進(jìn)行純化。

圖1 VLPVPR液相色譜圖Fig.1 HPLC of VLPVPR

圖2 VLPVPR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of VLPVPR

圖3 Sephadex G－10凝膠脫鹽實(shí)驗(yàn)Fig.3 Desalination experiments of Sephadex G－10

2.3 SP Sepharose Fast Flow靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

不同pH下SP Sepharose Fast Flow對VLPVPR標(biāo)準(zhǔn)品（1000mg/L）的吸附平衡曲線如圖4所示。

從圖中可以看出，SP Sepharose Fast Flow對VLPVPR的吸附屬于快速吸附平衡型，40min即可達(dá)到吸附平衡。達(dá)到吸附平衡后SP Sepharose Fast Flow在不同pH下對VLPVPR的吸附量如表2所示。

圖4 不同pH下的靜態(tài)吸附平衡曲線Fig.4 Static adsorption curves of different pH

理論上說，pH偏離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)（本實(shí)驗(yàn)為小于等電點(diǎn)），VLPVPR帶正電量越多，SP Sepharose Fast Flow對其吸附量越大。由于不同pH緩沖液采用不同配方（pH6.0～7.0 采用磷酸鹽緩沖液，pH7.5～8.5 采用 Tris－HCl緩沖液，pH9.0～10.0 采用 CHES 緩沖液），所以沒有呈現(xiàn)出類似的規(guī)律。結(jié)果表明，緩沖體系對離子交換劑的吸附有較大影響，在同一緩沖體系范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出一致的規(guī)律，pH越小，SP Sepharose Fast Flow吸附量越大。在pH7.5的Tris－HCl緩沖體系下，SP Sepharose Fast Flow對VLPVPR的吸附量最大，每毫升SP Sepharose Fast Flow吸附2.72mg VLPVPR，吸附率達(dá)到 53.6%。從表 2 還可以看出，當(dāng)起始 VLPVPR濃度為 1000mg/L時，SP Sepharose Fast Flow在不同pH條件下對VLPVPR的吸附率為 23.4% ～53.6% 。

2.4 SP Sepharose Fast Flow動態(tài)分離實(shí)驗(yàn)

SP Sepharose Fast Flow對VLPVPR溶液的吸附色譜圖如圖5所示。收集穿透峰，RP－HPLC檢測VLPVPR濃度為10.3mg/L，原樣品液中 VLPVPR濃度為85.4mg/L，經(jīng)計(jì)算其吸附率僅為3.5%。當(dāng)以同濃度（85.4mg/L）的VLPVPR標(biāo)準(zhǔn)品上柱時，吸附率為2.8%（圖 6）。結(jié)合靜態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明當(dāng)VLPVPR溶液中VLPVPR濃度太低時，SP Sepharose Fast Flow對VLPVPR的吸附率非常小，主要原因可能是上樣液中VLPVPR在與緩沖液中無機(jī)鹽離子和其它帶電離子（如其它多肽雜質(zhì)）競爭性吸附過程中處于劣勢。

2.5 Q Sepharose Fast Flow動態(tài)分離實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用10mmol/L pH9.0的CHES緩沖液作為Q Sepharose Fast Flow離子交換劑分離VLPVPR的吸附洗脫體系。在此pH環(huán)境下，VLPVPR帶正電荷，不能被Q Sepharose Fast Flow陰離子交換劑吸附，但Q Sepharose Fast Flow可以吸附大量帶負(fù)電的雜質(zhì)多肽，通過吸附雜質(zhì)來達(dá)到提高VLPVPR純度。不同上樣量對Q Sephasros Fast Flow分離VLPVPR的效果見表3。結(jié)果表明，上樣量對VLPVPR回收率的影響不大，回收率均達(dá)到90%以上。隨著上樣量的增加，VLPVPR的純度降低。綜合考慮上樣量、回收率和VLPVPR純度等因素，選擇上樣量為柱體積的10%。

表2 pH對VLPVPR吸附率的影響Table 2 Effect of pH on VLPVPR absorption rate

圖5 SP Sepharose Fast Flow對VLPVPR溶液的吸附色譜圖Fig.5 Adsorption chromatogram of SP Sepharose Fast Flow on VLPVPR

圖6 SP Sepharose Fast Flow對VLPVPR標(biāo)準(zhǔn)品（85.0mg/L）的吸附色譜圖Fig.6 Adsorption chromatogram of SP Sepharose Fast Flow on VLPVPR（85.0mg/L）

表3 上樣量對Q Sephasros Fast Flow分離效率的影響Table 3 Effect of sample quantity on the removal efficiency of impurities by Q Sephasros Fast Flow

3 結(jié)論

經(jīng)基因工程菌E.coliBL21（pGEX－4T－2－AHP）大規(guī)模發(fā)酵制得的VLPVPR，粗純化后樣品濃度較低，在與緩沖液中無機(jī)鹽離子和其它帶電離子競爭性吸附過程中處于劣勢，導(dǎo)致SP Sepharose Fast Flow對VLPVPR的吸附率非常小，SP Sepharose Fast Flow不適用于VLPVPR溶液的純化。

表4 不同分離介質(zhì)對VLPVPR分離效果Table 4 Effect on the separation of VLPVPR by different separating medium

綜合分析不同分離介質(zhì)對VLPVPR的分離效果，見表4。可知，采用Q Sepharose Fast Flow離子交換劑提高了VLPVPR的純度，回收率相對較高，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到醫(yī)藥領(lǐng)域的要求，需進(jìn)行進(jìn)一步純化，建議采用凝膠色譜等方法。

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