美拉德反應對豌豆蛋白水解物乳化性和抗氧化性的影響

張 欣，熊幼翎，陳 潔

（江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

酶法水解蛋白，不僅能夠提高蛋白的膳食營養吸收率，改善蛋白的溶解度，還能獲得完整蛋白所不具備的一些生理活性，如抗氧化性等［1－3］。然而，由于分子量降低，表面電荷增加，酶法水解又會破壞蛋白的一些功能性質，尤其是乳化性，進而影響了水解蛋白在食品加工中的應用。美拉德反應是蛋白自由氨基與還原糖羰基之間發生的非酶褐變反應，廣泛存在于食品加工和貯藏過程中。此反應中蛋白與糖發生共價結合，能夠有效地改善蛋白的功能性質，如溶解性、乳化性和熱穩定性等［4－6］。由于美拉德反應普遍存在且不需添加化學催化劑，因此是蛋白改性的一種行之有效的方法。

豌豆蛋白是近年來新興的一種優質蛋白，不僅價格低廉，營養價值高，還具有低致敏等特點［7－8］。本文擬采用不同商業蛋白酶制備的豌豆蛋白水解物為原料，考察不同分子大小的糖（葡萄糖、麥芽糊精和葡聚糖）對其乳化活性及抗氧化活性的影響，從而探索提高豌豆蛋白水解物功能性質的有效途徑，為制備兼具良好乳化性的抗氧化豌豆蛋白水解物提供實驗依據和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豌豆分離蛋白（pea protein isolate，PPI）（等電點沉淀法提取［9］，蛋白含量≥90%）;堿性蛋白酶（Alcalase）、風味蛋白酶（Flavorzyme）、復合蛋白酶（Protamex） 購自諾維信公司;葡萄糖、麥芽糊精（葡萄糖當量 13.0～17.0）、2，4，6－三硝基苯磺酸、抗壞血酸、大豆卵磷脂 購自Sigma公司;葡聚糖（分子量40000） 購自美國Spectrum公司;亞硫酸鈉、三氯化鐵、三氯乙酸、硫代巴比妥酸等 購自美國Fisher公司。

UV－2401PC紫外掃描分光光度計 日本Shimadzu公司;Precision 280－Series恒溫水浴鍋 美國Thomas公司;Polytron PT10/35均質器 美國Capitol公司;Sorvall RC－5B離心機 美國Sorvall公司;Fluoro Max－3熒光分光光度計 美國Horiba公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豌豆蛋白水解物（PPH）的制備 參照 Zhang等［10］的方法將加熱（90℃，5min）處理的 2g/100mL豌豆蛋白溶液分別與堿性蛋白酶、風味蛋白酶和復合蛋白酶作用0.5h。滅酶結束后將各水解物pH調節至7.0，并在9000g離心10min除去不溶顆粒。樣品凍干并在4℃保存。

1.2.2 美拉德反應產物的制備 參照Zhu［11］等的方法，采用相對溫和的條件將反應盡量控制在初期即生成大量希夫堿的階段。因此，將豌豆蛋白水解物分別與葡萄糖、麥芽糊精和葡聚糖混合于50mmol/L，pH7.0的磷酸鹽緩沖液中，得到蛋白水解物和糖終濃度分別為2%和10%的混合物。將混合物轉移至具塞試管中，60℃反應48h。豌豆蛋白水解物在相同條件下加熱，做為對照組。反應完成后立即放入冰水中冷卻，并在4℃存放。

1.2.3 游離氨基含量測定 參照 Benjakul和Morrissey［12］的方法，以2mmol/L亮氨酸做標準曲線，采用2，4，6－三硝基苯磺酸法進行測定（樣品稀釋20倍）。

1.2.4 希夫堿生成量測定 樣品（稀釋20倍）以3300×g離心10min。上清液在280～400nm進行紫外掃描。以加熱但未加糖的豌豆蛋白水解物做空白。希夫堿的生成量以304nm處峰值的大小表示［11］。

1.2.5 內源色氨酸熒光測定 樣品（稀釋20倍）以3300×g離心10min。上清液在激發波長295nm，發射波長300～400nm下掃描，狹縫寬度均為5nm。以10mmol/L，pH7.0磷酸鹽緩沖液做空白。

1.2.6 SDS－PAGE 濃縮膠和分離膠丙烯酰胺濃度分別為5%和12%。樣品稀釋至蛋白濃度4mg/mL，再與樣品緩沖液等體積混合，加熱 3min，上樣 15μL［13］。

1.2.7 乳化性測定

1.2.7.1 乳狀液的制備 用磷酸鹽緩沖液（10mmol/L，pH7.0）稀釋各反應物到蛋白濃度為5mg/mL，再與大豆油以3∶1體積混合，用分散器以13600r/min的速度分散2min。將制備好的乳狀液迅速倒入平底小燒杯中。

1.2.7.2 乳化活性和乳化穩定性的測定 在離燒杯底部0.5cm處取剛制備好的乳狀液15μL于5mL 0.1%SDS溶液中，混勻后在500nm處測定吸光值。乳化活性指標（EAI）用0時刻吸光值A0表示。乳化穩定性指標ESI（%）=（At/A0）×100，其中A0和At分別表示放置0和t（t=30min）時間的乳狀液的吸光度值［14］。

1.2.8 抗氧化性測定 （抑制脂質體氧化能力）參考Sinnhuber等［15］的方法，將樣品與脂質體溶液（0.2mg/mL大豆卵磷脂）混合，加入100μmol/L三氯化鐵 和2mmol/L抗壞血酸引發脂肪氧化，并在37℃保溫1h。加入1g/100mL硫代巴比妥酸溶液和2.8g/100mL三氯乙酸溶液，沸水浴反應15min，冷卻到室溫。加入5mL氯仿去除脂類的影響，上層溶液在532nm波長處測吸光度。硫代巴比妥酸反應物（TBARS）生成量表示為每升脂質體溶液所含丙二醛的毫克數（mg/L）。

1.2.9 統計分析 每個實驗重復3次，結果表示為平均值±標準差;數據統計分析采用Statistix 9.0軟件中線性模式，顯著性分析采用最小顯著性法（LSD）檢驗，p＜0.05 認為差異顯著。

2 結果與討論

2.1 游離氨基含量

由于酶的分解活力、作用位點等的差異，不同蛋白酶水解物的水解度差異顯著［16］，因而也導致了相同蛋白濃度下各水解物的游離氨基含量有所不同。由圖1可知，豌豆蛋白水解物與糖反應48h后，游離氨基含量明顯下降，表明α－或ε－氨基結合到糖分子的羰基上，生成了糖基化產物。通常，游離氨基含量下降的程度可用來衡量美拉德反應的強度和糖類的反應活性［17］。由此可見，葡萄糖的反應活性最大，美拉德反應最強烈，其次為麥芽糊精和葡聚糖。對照組（加熱豌豆蛋白水解物）的游離氨基含量亦略有下降，可能由于賴氨酸殘基或精氨酸的胍基發生交聯導致［18］。不同蛋白酶水解物反應體系顯示了相似的游離氨基變化趨勢。

圖1 豌豆蛋白酶水解物與糖美拉德反應體系的游離氨基含量變化Fig.1 Free amine content of Maillard－type PPH－saccharide complexes.

2.2 希夫堿生成量

希夫堿是美拉德反應初級階段的產物，沒有明顯的顏色變化，且具有良好的功能性質。有文獻報道，304nm可作為衡量希夫堿生成量的吸收波長，也可作為衡量蛋白和糖聚合程度的指標［11］。從圖2可以看出，體系反應48h后，各產物在304nm處的吸光值均有所增加，表明希夫堿物質的生成。葡萄糖參與的反應體系的希夫堿生成量遠高于麥芽糊精和葡聚糖，表明該糖反應最劇烈，葡聚糖參與的反應體系的希夫堿生成量最低，表明該糖反應最溫和，這一結果與游離氨基含量變化一致。此外，各反應物在可見波長區的吸收也有所增加，可能是生成了一些美拉德分解產物的發色團［19］。

圖2 豌豆蛋白酶水解物與糖的美拉德反應產物中希夫堿的生成量Fig.2 Schiff base production in the Maillard conjugation of PPHs and saccharides

2.3 內源色氨酸熒光

色氨酸殘基所處微環境的極性會影響其熒光最大發射波長，故色氨酸的內源熒光性可反映蛋白質內部結構的變化［20］。圖3表明，美拉德反應產物的熒光最大發射波長較對照組（加熱豌豆蛋白水解物）發生紅移，最大波長由356nm移動至361nm。說明豌豆蛋白水解物因與糖發生共價交聯而使色氨酸殘基暴露于更加親水的環境中。葡聚糖衍生的反應物的最大發射波長幾乎沒有移動，表明其與豌豆蛋白水解物反應程度最低，故而對水解物的內部疏水結構影響最小。所有美拉德反應產物的熒光強度都較對照組有所降低，說明糖分子共價接合于水解物的表面，從而屏蔽了其內部的熒光強度。所有糖中，葡萄糖衍生的反應物的熒光強度最低，發射波長最長，進一步證明了葡萄糖的反應活性最大，美拉德反應最強烈。

圖3 豌豆蛋白酶水解物與糖的美拉德反應產物的熒光強度變化Fig.3 Intrinsic fluorescence intensity of Maillard－type PPH－saccharide complexes

2.4 SDS－PAGE

由圖4可見，豌豆蛋白水解物與糖發生共價結合后，產物的電泳條帶不同程度地向著更高分子量移動，說明美拉德反應生成了高分子量的共聚物。所有糖中，葡聚糖衍生的反應物的分子量增加最多（堿性蛋白酶處理的反應物除外），可在分離膠的上部看見深色的大分子物質條帶。葡萄糖和麥芽糊精因分子量相對較小，故反應物分子量增加亦較小，反應前后電泳條帶變化不顯著。三種酶水解物中，堿性蛋白酶水解物由于自身分子量低，故美拉德反應產物分子量提高不明顯，即使與葡聚糖生成的反應物，在電泳圖中仍無法識別。復合蛋白酶水解物與葡聚糖的反應物分子量提高最為明顯（如箭頭所指），表明該酶水解物的美拉德反應活性最高。

圖4 豌豆蛋白酶水解物與糖的美拉德反應產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖（非還原性）。Fig.4 SDS－PAGE of Maillard－typePPH－saccharide complexes under non－reducing condition

2.5 乳化性

如圖5所示，風味蛋白酶和復合蛋白酶水解物發生美拉德反應后，乳化活力（EAI）明顯高于反應前（p＜0.05）。可見，豌豆蛋白水解物發生糖基化反應后，空間結構和親水－疏水平衡得到改善，使其更利于吸附到油水界面。通常認為，反應物中的蛋白部分能夠降低油水界面的張力并在油滴表面形成界面膜，而接合的糖分子則能夠在界面膜周圍形成立體網狀結構，增加界面膜的厚度和機械強度［21］。ESI值計算與EAI值有關，故結合EAI數據可知各美拉德反應產物具有較高的乳化穩定性，即能夠在脂肪球表面形成一層堅實的保護膜，防止液滴聚集、合并。雖然葡聚糖的美拉德反應程度最低，但其分子結構最大，能夠明顯地修飾多肽分子的空間結構，因此，顯著地改善了豌豆蛋白水解物的乳化性。此外，大分子葡聚糖亦可在水相中通過增稠作用提高乳化穩定性。對復合蛋白酶水解物的各美拉德反應產物制備的乳狀液進行顯微鏡觀察（如圖6），得到了與EAI和ESI測定一致的結論，即隨著糖分子結構增大，美拉德反應產物的乳化性逐漸提高，乳化顆粒逐漸增多，且顆粒粒徑逐漸減小。

2.6 抗氧化性（抑制脂質體氧化能力）

由表1可知，三種豌豆蛋白水解物均具有顯著抑制脂質體氧化的能力（p＜0.05），尤其是風味蛋白酶和復合蛋白酶水解物。這與三種水解物具有極強的自由基清除能力和金屬離子螯合能力有關［16］。此外，豌豆蛋白水解物亦能夠在脂質體顆粒表面形成一層保護壁壘，從而阻斷氧化脅迫對脂肪顆粒的損傷［10］。各水解物與糖發生共價結合后，因糖種類不同對其抑制脂質體氧化能力產生了不同的影響。其中，葡萄糖衍生的反應物的抗氧化活性最差。與對照組相比，甚至表現出促氧化作用。原因可能是葡萄糖的反應活性最高，因此消耗的多肽氨基側鏈也最多，故而導致一些具有抗氧化活性的氨基酸缺失或失活。葡聚糖衍生的反應物的抑制脂質體氧化能力最強，這與其反應溫和，對多肽結構影響小有關。葡聚糖與復合蛋白酶水解物的反應物顯示了最高的抗氧化活性。可見，在利用初期美拉德反應制備功能性豌豆蛋白水解物的同時，亦能夠很好地保留多肽的抗氧化活性。

圖5 豌豆蛋白酶水解物與糖的美拉德反應產物的乳化活性和乳化穩定性。Fig.5 EAI and ESI of Maillard－type PPH－saccharide complexes

3 結論

通過美拉德反應使豌豆蛋白水解物與糖分子發生共價結合，能夠有效地改善豌豆蛋白水解物的乳化活性，并能夠保留水解物自身的抗氧化活性。葡聚糖，雖然反應活性低于小分子糖，但能夠顯著地修飾多肽分子的空間結構（形成高分子共聚物），從而明顯改善豌豆蛋白水解物的乳化活性。此外，葡聚糖亦能在水相中起增稠、穩定的作用。所以，利用葡聚糖參與的美拉德反應，可以獲得兼具良好乳化性和高抗氧化活性的豌豆蛋白水解物。

表1 豌豆蛋白酶水解物與糖的美拉德反應產物對脂質體氧化（TBARS生成量）的抑制作用Table 1 Inhibition of lipid oxidation（TBARS formation）by Maillard－type PPH－saccharide complexes

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