產(chǎn)酸性蛋白酶菌株分子鑒定和酶學(xué)性質(zhì)研究

侯進(jìn)慧，趙明濤

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇徐州 221008;2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221008）

蛋白酶是催化多肽或蛋白質(zhì)水解的一類(lèi)酶，其分類(lèi)方法有多種，可以根據(jù)活性中心分類(lèi)，或者以作用方式來(lái)分類(lèi)，也有的以最適pH來(lái)分類(lèi)。在傳統(tǒng)過(guò)程中，蛋白酶通常按照最適pH來(lái)區(qū)分，分成三類(lèi):包括酸性、中性和堿性蛋白酶，其中酸性蛋白酶最適pH 范圍在 2.0～6.0，中性蛋白酶最適 pH 范圍在 6.0～9.0，堿性蛋白酶最適pH范圍為9.0以上。按照活性中心來(lái)分，蛋白酶可以分成絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶等四大類(lèi)。蛋白酶的專(zhuān)一性對(duì)于酶的應(yīng)用至關(guān)重要，某些場(chǎng)合專(zhuān)一性的微小差異，也足以造成截然不同的效果。其中，酸性蛋白酶是一種能在酸性環(huán)境下水解蛋白質(zhì)的酶類(lèi)，具有較好的耐酸性。因此被廣泛地應(yīng)用于食品、釀造、醫(yī)藥、輕工、皮革工藝以及飼料加工工業(yè)中［1－6］。

由于微生物的生活環(huán)境差別大、種類(lèi)多樣，與動(dòng)植物蛋白酶相比，微生物蛋白酶呈現(xiàn)出多樣性和復(fù)雜性的特征［7－8］。不同微生物菌種分泌的酸性蛋白酶雖然具有一些共同的性質(zhì)，但是在底物特異性、作用條件、抑制劑等方面均有著一定的差別。比如米曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶的活性 pH 范圍為 3.0～6.0，最適作用 pH 為 3.0～4.0［5］。宇佐美曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶的活性 pH 范圍為 2.0～3.5，最適作用 pH2.5。從Hebeloma crustulinifomel分離的一種酸性蛋白酶的活性溫度范圍在45～60℃之間，最適作用溫度為50℃;菌種DH－C40所產(chǎn)的酸性蛋白酶的活性溫度范圍在35～55℃ 之間，最適作用溫度為 40℃［2］。從微生物中，篩選開(kāi)發(fā)新型產(chǎn)酸性蛋白酶菌株，可為人們提供性質(zhì)不同的蛋白酶應(yīng)用于生產(chǎn)與研究。

本文對(duì)篩選到的一株產(chǎn)酸性蛋白酶菌株P(guān)X8進(jìn)行了分子鑒定和酶學(xué)特征研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其酸性蛋白酶產(chǎn)品提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)篩選到的產(chǎn)蛋白酶菌株分離自蘇北地區(qū)的農(nóng)田土壤。從采樣地收集土壤后，同日到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離、篩選。

酪素、乳酸、酪氨酸、碳酸鈉分析純生化試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Taq酶、DNA Marker分子生物學(xué)試劑 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司;液體 LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g;固體LB培養(yǎng)基還需加瓊脂粉12g［9］;1L固體篩選培養(yǎng)基:葡萄糖10g，蛋白胨5g，氯化鈉10g，脫脂奶粉 20g，瓊脂粉 12g［10］。

EBA21臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)SIGMA公司;DYCP－31E電泳儀 北京市六一儀器廠;DNP9002電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;MDF－382E超低溫冰箱 日本SANYO電子有限公司。

1.2 菌株16S rDNA序列分析

提取菌株 PX8基因組DNA，作為 PCR反應(yīng)模板。16S rDNA擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物:F:5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，R:5′GGTTACCTTG TTACGACTT3′。在50μL PCR反應(yīng)體系中，依次加入以下成分:5μL的10×PCR反應(yīng)緩沖液，4μL的dNTP，1μL的F和R引物，1μL的PX8基因組DNA，0.5μL的Taq DNA聚合酶，加無(wú)菌超純水補(bǔ)足體積。序列擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s，54℃退火60s，72℃ 延伸 90s，重復(fù)步驟 2～4，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。將菌株P(guān)X8的16S rDNA片斷送“上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司”測(cè)序，分析菌株分類(lèi)地位［11］。

1.3 酸性蛋白酶活性分析

1.3.1 溶液的配制 酪素溶液（10g/L）:稱(chēng)取1g酪素，加5mL去離子水溶解，加0.5mol/L乳酸溶解，加入適量pH為3.0乳酸－乳酸鈉緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，冷卻后，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用pH3.0乳酸－乳酸鈉緩沖液定容至100mL，此溶液放冰箱中保存。

標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液（100μg/mL）:精確稱(chēng)取預(yù)先在105℃干燥2～3h的L－酪氨酸0.1g，置于容量瓶中，緩慢加入6mL的1mol/L HCl使之溶解，用0.2mol/L HCl定容至100mL，可獲得1mg/mL酪氨酸溶液，取該溶液 10mL，用 0.2mol/L HCl定容至 100mL，即成100μg/mL酪氨酸溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取1mL 100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液至一個(gè) 10mL容量瓶，加入 5mL 0.4mol/L NaCO3溶液、1mL福林試劑，混合均勻，置于（40±0.2）℃水浴顯色20min，顯色后，以不含酪氨酸的0管為空白，使用分光光度計(jì)在680nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值，做三次平行實(shí)驗(yàn)。以吸光度A為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 酶活測(cè)定 將酪素溶液放入（40±0.2）℃恒溫水浴中，預(yù)熱5min。取5mL離心管，向其中加入1mL酶液，在（40 ±0.2）℃ 的條件下加熱 2min，再加入2mL 0.4mol/L 三氯乙酸，振蕩搖勻，在（40 ±0.2）℃下反應(yīng)10min，然后向離心管中加1mL 10g/L酪素，搖勻，取出靜置，反應(yīng)10min。在10000r/min下離心1min，取 1mL 上清至容量瓶中，加入 5.0mL 0.4mol/L的NaCO3溶液和1mL福林試劑，在（40±0.2）℃，顯色20min，在680nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度。

取5mL的離心管，加入1mL酶液，在（40±0.2）℃下加熱2min，再加入1mL 10g/L酪素，充分混勻，在（40±0.2）℃下反應(yīng)10min;然后向離心管中加入2mL 0.4mol/L三氯乙酸，充分混勻，取出靜置，反應(yīng)10min;在 10000r/min 下離心 1min，取 1.00mL 上清液加到 10mL容量瓶中，再加入 5mL 0.4mol/L NaCO3溶液和1mL福林試劑，在（40±0.2）℃顯色20min，將樣品在680nm 波長(zhǎng)測(cè)量吸光度［10］。

1.3.4 酶活力計(jì)算

酶活力定義:1mL液體酶，再一定溫度和pH條件下，1min水解干酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸，即為一個(gè)酶活力單位，以 U/g 或 U/mL 表示［1，5］。

酸性蛋白酶酶活測(cè)量公式:

式中:X－樣品酶活力，（U/mL）;A－樣品平行測(cè)試的平均吸光度;K－吸光常數(shù);4－反應(yīng)試劑的總體積，mL;10－反應(yīng)時(shí)間10min，以1min計(jì);n－稀釋倍數(shù)（酶稀釋倍數(shù)n=1）。

1.4 正交實(shí)驗(yàn)分析

菌株P(guān)X8所產(chǎn)酸性蛋白酶活性受到多個(gè)因子的影響。本文進(jìn)行了四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，以確定最優(yōu)酶活性的條件，表1為因素與水平。以不同的影響因子條件下，用福林試劑測(cè)定酸性蛋白酶活性，以酸性蛋白酶活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確立正交實(shí)驗(yàn)因素，用正交實(shí)驗(yàn)法確定各因素的最佳條件，分析不同影響因子下的酸性蛋白酶活性，從而確定最適的組合水平，獲得較高的酶活值。

表1 影響因素與水平表Table 1 Factors and levels concerned

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分子鑒定

利用透明水解圈法篩選到一株產(chǎn)酸性蛋白酶菌株P(guān)X8（圖1A）。通過(guò)PCR獲得菌株 PX8的16S rDNA片段（圖1B），經(jīng)生物公司測(cè)序，使用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該序列與軟腐果膠桿菌Pectobacteriumcarotovorum subsp.carotovorum strain Ecc1－9（FJ527461）的 16S rDNA 序列最相似，相似性達(dá)100%。將該菌株命名為Pectobacteriumsp.PX8。

圖1 菌落透明圈和16S rDNA片段Fig.1 Colony transparent circle and 16S rDNA fragment

2.2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

制作的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）顯示，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)為680nm時(shí)，酪氨酸濃度在0～50μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。其回歸方程為 y=0.0101x+0.0085，R2=0.9972，k=98.168。

圖2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Tyrosine standard curve

2.3 各影響因子對(duì)菌株蛋白酶活力的影響

2.3.1 菌株酸性蛋白酶反應(yīng)溫度分析 改變酶促反應(yīng)溫度，分析溫度對(duì)酶活的影響。所分析的溫度分別為20 、30 、40 、50 、60℃。圖3顯示，在20～40℃范圍內(nèi)，菌株P(guān)X8酸性蛋白酶的活力隨溫度的升高而增加，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，蛋白酶活力最大;超過(guò)40℃后，溫度升高，蛋白酶活力逐漸下降。結(jié)果顯示，菌株P(guān)X8酸性蛋白酶的最適溫度是40℃。

圖3 溫度對(duì)酶活性的影響Fig.3 Effect of temperature on enzyme activity

2.3.2 菌株酸性蛋白酶反應(yīng)pH分析 選用不同的催化反應(yīng) pH，所分析的 pH 分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，以pH在4.0時(shí)的酶活性為100%，分析酸性蛋白酶活隨著pH的變化情況結(jié)果如圖4。結(jié)果顯示，菌株P(guān)X8酸性蛋白酶在pH 4.0時(shí)相對(duì)酶活較高，說(shuō)明pH4.0是該菌株酸性蛋白酶適合的反應(yīng)條件。但是當(dāng)pH過(guò)高或過(guò)低時(shí)均明顯影響酶活力，在pH為2時(shí)，酶活力只有 65.49%，在 pH 為 6.0 時(shí)，酶活也只有 42.88%。

圖4 pH對(duì)酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on enzyme activity

2.3.3 不同離子對(duì)菌株酸性蛋白酶活力的影響 選擇 1mg/mL Fe2+、Mn2+、Cu2+、Ca2+和 Ni2+等金屬離子，以不添加金屬離子的反應(yīng)體系為對(duì)照，分析不同離子存在條件下菌株酸性蛋白酶酶活，以不添加金屬離子的酶活性為100%，結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，不同的金屬離子對(duì)菌株P(guān)X8酸性蛋白酶的活力影響各異，加入Fe2+、Mn2+和Cu2+酶活均高于不加無(wú)機(jī)離子時(shí)的酶活，F(xiàn)e2+、Mn2+和Cu2+對(duì)酸性蛋白酶有激活作用，而且 Fe2+的激活作用最強(qiáng)，相對(duì)酶活達(dá)到116.4%，而加入Ca2+、Ni2+離子時(shí)酶活均低于不加無(wú)機(jī)離子時(shí)的酶活，說(shuō)明Ca2+和Ni2+對(duì)菌株P(guān)X8酸性蛋白酶有抑制作用，Ni2+的抑制作用更明顯。

圖5 金屬離子對(duì)酶活性的影響Fig.5 Effect of ions on enzyme activity

2.3.4 不同的Fe2+濃度對(duì)菌株酸性蛋白酶活力的影響 不同濃度金屬離子對(duì)酸性蛋白酶活性影響不同，本實(shí)驗(yàn)選擇激活作用較強(qiáng)的Fe2+來(lái)促進(jìn)菌株P(guān)X8酸性蛋白酶活性，以不添加金屬離子的酶活性為100% ，分析 0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mg/mL Fe2+時(shí)菌株P(guān)X8酸性蛋白酶酶活，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，F(xiàn)e2+濃度在0.9mg/mL時(shí)，相對(duì)酶活達(dá)到131.5%，在 Fe2+濃度低于或高于0.9mg/mL時(shí)，激活作用降低，當(dāng)Fe2+濃度達(dá)到1.5mg/mL時(shí)，對(duì)酶活有抑制作用。

2.3.5 不同發(fā)酵時(shí)間菌株酸性蛋白酶活力 分析不同發(fā)酵時(shí)間菌株酸性蛋白酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖7。結(jié)果顯示，在發(fā)酵培養(yǎng)64h時(shí)，相對(duì)酶活達(dá)到最大值。

圖6 Fe2+對(duì)酶活性的影響Fig.6 Effect of Fe2+on enzyme activity

圖7 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活性的影響Fig.7 Effect of cultivation time on enzyme activity

2.3.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定菌株最優(yōu)酶活性條件，結(jié)果見(jiàn)表2。表中R值顯示，四種結(jié)果對(duì)酸性蛋白酶活性的影響順序?yàn)?C＞B＞A＞D，即Fe2+離子濃度對(duì)酸性蛋白酶活性的影響最大，其次為pH、溫度和反應(yīng)時(shí)間的影響，由表可知最優(yōu)組合是 C2B2A2D2，即 Fe2+濃度是 1.2mg/mL，溫度是40℃，pH是4，反應(yīng)時(shí)間是10min，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，此條件下的酶活達(dá)到最大值34.625 U/mL。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experiment

2.4 討論

溫度對(duì)酶催化反應(yīng)有兩種效應(yīng)，在一定范圍內(nèi)，溫度的升高，從而使酶反應(yīng)速度增加。如果超過(guò)這個(gè)范圍，溫度的升高，就會(huì)引起酶變性，從而引起酶反應(yīng)的失效［12］。在溫度比較低的范圍內(nèi)，隨著溫度升高，主要作用的是加速反應(yīng)，因而在一定的范圍內(nèi)蛋白酶的活力會(huì)隨著溫度的升高而增加;但是當(dāng)超過(guò)這個(gè)溫度范圍時(shí)，隨著溫度的升高，蛋白酶失效就會(huì)占據(jù)主導(dǎo)地位，從而蛋白酶活力隨著溫度升高而下降。選用不同的溫度，測(cè)量溫度分別為20、30、40、50、60℃時(shí)酸性蛋白酶酶活。袁康培等［13］指出黑曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶，在不同的發(fā)酵溫度下產(chǎn)蛋白酶的能力顯著不同，溫度為28℃時(shí)產(chǎn)蛋白酶的比活力最大。費(fèi)笛波等［14］對(duì)黑曲霉6042飼用酸性蛋白酶進(jìn)行了研究，研究表明，適宜作用溫度范圍在40～50℃之間，而在47.5℃時(shí)，產(chǎn)蛋白酶量的含量最高。這種酸性蛋白酶的最適溫度不同，是因?yàn)槭紫瓤赡苁怯捎诰瓴煌斐傻模环N微生物的不同的菌株所產(chǎn)生的酶也會(huì)在性質(zhì)上有很大的差異。同一種酶在不同條件下的適宜溫度也不是一成不變的，其次要受到酶的純度、底物、激活劑、抑制劑以及酶促反應(yīng)時(shí)間等因素的影響。一般認(rèn)為，溶液的pH通過(guò)影響蛋白酶活性中心結(jié)構(gòu)及與活性中心有關(guān)的基團(tuán)的解離，從而影響酶的活性［15］。當(dāng)有利于酶分子與底物進(jìn)行結(jié)合，蛋白酶的活力就比較高。當(dāng)外界環(huán)境或溶液pH發(fā)生改變，蛋白酶活性中心結(jié)構(gòu)及與活性中心有關(guān)的基團(tuán)的解離的情況就會(huì)發(fā)生改變，從而使蛋白酶從活性狀態(tài)轉(zhuǎn)入無(wú)活性態(tài)，引起活力下降甚至完全失活。對(duì)由酸性蛋白酶催化而說(shuō)，無(wú)機(jī)金屬離子通過(guò)與底物的活性部位相結(jié)合，或間接與底物的特殊構(gòu)象結(jié)合，來(lái)控制催化反應(yīng)的進(jìn)行［16］。李衛(wèi)芬［17］研究認(rèn)為，F(xiàn)e2+對(duì)酸性蛋白酶有一定的激活作用，而Mn2+、Ca2+和Cu2+則呈現(xiàn)強(qiáng)弱不同的抑制作用。劉娜等［18］認(rèn)為 Cu2+、Mn2+、Ca2+三種離子在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)黑曲霉產(chǎn)生酸性蛋白酶活性是有激活作用的，而Fe2+對(duì)酸性蛋白酶活性基本只呈抑制作用。以上研究結(jié)果與本文的研究結(jié)果不盡一致，一是設(shè)定的離子濃度不完全相同，二是可能由于酶的來(lái)源不同，從而導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)不同。這與洪法水［19］對(duì)酶活性與重金屬例子關(guān)系的研究結(jié)果相一致，低濃度重金屬離子對(duì)酶活性有激活作用，高濃度則嚴(yán)重抑制酶活性。

3 結(jié)論

本文研究的產(chǎn)酸性蛋白酶菌株P(guān)X8，經(jīng)分子鑒定為Pectobacteriumsp.菌株，該菌株所產(chǎn)酸性蛋白酶在40℃、pH4，含有 1.2mg/mL Fe2+的反應(yīng)體系中，反應(yīng)10min，酶活達(dá)到最大值34.625U/mL，具有較高的蛋白酶活性，可供進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高活性的酸性蛋白酶產(chǎn)品。

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