茯磚茶分離菌對初烤煙葉的改質效果

瞿嬌嬌，張曉敏，施 鳴，吳有祥，石志發，劉仁祥，鄒 曉，，*

（1.貴州大學真菌資源研究所，貴州貴陽 550025;2.貴州省煙草品質研究重點實驗室，貴州貴陽 550025;3.貴州中煙工業有限責任公司，貴州貴陽 550002）

煙葉發酵是改善品質的重要環節，其實質上是在一定的環境條件下，使煙葉理化特性發生改變，煙葉的香氣、吸味等品質明顯改善的加工過程［1］。在此過程中，微生物是推動發酵、提高煙葉品質的重要因素之一。國外學者Tamayo最先開展了微生物接種煙葉以增加香氣的實驗［2］，English等從發酵煙葉上分離出嗜熱細菌，這些菌株單獨或混合用于煙葉，都可產生悅人的芳香［3］。在國內，有利用優勢增香菌株和酶類制成煙草發酵增質劑對人工發酵和自然醇化過程煙葉進行處理［4］;有利用分離自不同生境煙葉上的真菌菌劑處理上部烤煙煙絲［5］;還有利用食用菌發酵初烤煙葉，改善煙葉品質的報道［6］。這些研究結果都顯示，煙葉中人為添加各種優勢微生物及酶制劑來加快醇化進程、提高品質、降低有害物質含量是微生物發酵技術在煙葉醇化上應用的一個熱點，因此開發一些新的微生物資源用于煙葉醇化（發酵）、減害對于煙葉的復烤和醇化過程有較重要的意義。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是茯磚茶“發花”過程中的優勢菌種，對茯磚茶獨特品質的形成具有重要的作用，它從茶葉中獲取營養物質，進行自身代謝轉化，同時產生各種胞外酶催化茶葉中各種相關物質發生氧化、聚合、降解、轉化，基本完成茯磚茶特有的色、香、味品質的物質轉化［7］。此外，冠突散囊菌還含有豐富的酶系［8］，能在較為干旱的環境下生長［9］，在發酵茶葉過程中對部分真菌、細菌和酵母的生長具有不同程度的抑制作用［10］。冠突散囊菌發酵茶葉的過程和卷煙醇化過程很相似，基于此，本研究首次將冠突散囊菌用于煙葉發酵，充分利用冠突散囊菌的生理特性，以期達到改善初烤煙葉品質的效果，為煙葉發酵、減害開發新的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶葉 市售茯磚茶;菌株 冠突散囊菌（Eurotium cristatum），分離自茯磚茶，菌株保藏號為:CCTCC，M2012367，貴州大學真菌資源研究所保存備份菌株;煙葉 煙草品種云85，煙葉等級B3F，產地:中國煙草總公司貴州省公司福泉基地;培養基 PDA培養基:馬鈴薯200g（切塊，煮水30min，4層紗布過濾取汁）、葡萄糖 20g、瓊脂 20g、蒸餾水1000mL，pH自然，1 ×105Pa，20min;CZG 培養基:蔗糖 40g，磷酸氫二鉀 1g，硝酸氨 3g，氯化鈉 50g，硫酸鎂 0.5g，瓊脂20g，蒸餾水 1000mL，pH 自然，1 ×105Pa，20min;M40y培養基:蔗糖400g，麥芽20g，酵母膏5 g，瓊脂20g，水1000mL，pH 自然，滅菌條件 1 ×105Pa，20min;試劑盒D3195－01，Omega bio－tek HP Fungal DNA 試劑盒。

BK5000Motic顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司;TC－96 PCR儀 杭州博日科技有限公司;MicroCL－17高速離心機 美國賽默飛世爾科技公司;DYY－10C水平電泳儀 北京六一儀器廠;Master－D Hitech－Sciencetool超純水機 上海和泰儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冠突散囊菌菌株的分離純化 選取“發花”好的茯磚茶，用接種針挑取茶磚上的“金花”接種于PDA培養基平板上，置于30℃培養箱中培養，將菌落邊緣無雜菌污染處轉接于PDA平板純化后備用。

1.2.2 冠突散囊菌菌株的鑒定 該菌在CZG培養基上形成子囊孢子，在M40y培養基上主要形成分生孢子，將分離到的菌株分別接種于上述兩種培養基上，觀察形態特征。從PDA平板上刮取無菌菌絲體用于DNA 的提取，根據 Tigano－Milani等［11］的方法進行提取。參照White等［12］的方法，以該菌基因組DNA為模板，擴增ITS區的rDNA－ITS，通用引物選用ITS5（5′－ GGTGAGAGATTTCTGTG － 3′）和 ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC3′），PCR 產物送由上海Invitrogen公司純化和測序。測序結果經BioEdit等軟件分析和手工校正后，用 NCBI的 BLAST（2.2.12 version）程序將測出的序列分別與在 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）中已知菌種的ITS序列進行同源性比較分析。選取MEGA 5.2軟件用Bootstrap構建ITS序列系統進化樹，進行系統發育分析［13］。條件設置為:鄰接法（NJ）、重復次數（Replications）1000。

1.2.3 菌劑制備與煙葉接種 冠突散囊菌采用點接法接種到M40y培養基上，于30℃下培養7d。用無菌水洗孢子制成濃度為1 ×108、1 ×107、1 ×106個/mL，3個梯度的孢子懸液。將3個梯度的孢子懸液用噴霧器均勻噴施于煙葉，接種量為5%，每種濃度3個重復，對照用等量無菌水代替，其他處理相同。于溫度25、30、35℃，濕度70% ±2%下發酵培養50d。

1.2.4 煙葉理化分析方法 還原糖、水溶性總糖、煙堿、全鉀、蛋白質、石油醚浸提物等指標的測定參見王瑞新等人的方法［14］。

1.2.5 煙葉評吸 感官品質的鑒定方法參考國標GB 5606.4－2005 和煙草行業標準 YC/T 138－1998。

2 結果與分析

2.1 冠突散囊菌形態描述

CZG培養基上菌落周邊近于橄欖淺黃色，內部顏色較深，近于橄欖褐至丁香褐色;閉囊殼大量，包纏于菌絲中，培養后期菌落中有少量滲出液，呈小滴狀，黑褐色，色素擴散于基質中。M40y培養基上菌落為黃色，菌株形成的菌落較密集，邊緣顏色較淺，鏡檢發現菌落基本由菌絲組成，并有灰綠色分生孢子頭產生。

2.2 冠突散囊菌孢子形態特征

冠突散囊菌是產生有性型（子囊孢子階段）和無性型（分生孢子階段）的全型真菌。閉囊殼球形或近球形，黃色，直徑90～310μm;子囊球形至近球形，壁薄易破，10.0～17.5μm;子囊孢子雙凸鏡形，具有兩個明顯的冠狀突起，大小為 4.0～6.0 ×3.0～5.8μm，凸面明顯粗糙。分生孢子頭輻射狀到柱頭，灰綠色;頂囊近球形或燒瓶形，直徑一般為10～45μm，瓶梗 3.8～9.06 ×4.0μm;分生孢子橢圓形，少數近球形，壁粗糙具小刺，大小為 3.0～6.0 ×2.5～5.8μm。

圖1 冠突散囊菌菌落形態及顯微結構特征Fig.1 The colony morphology and microstructure features of E.cristatum

2.3 冠突散囊菌rDNA－ITS序列分析

該菌株經總DNA提取、測序后，所得ITS序列為604bp，提交Genbank數據庫進行 Nucleotide blast比對，發現所用菌的 ITS－5.8S 的序列與 EF652001.1（Eurotium cristatum，NRRL 4222）的相似性為99%。進行系統發育分析顯示，以球孢白僵菌（Beauveria bassiana）作為外群，圖2分為上下2個分支，由于該屬與Aspergillus屬、Penicillium屬關系密切，如E.cristatum的 無 性 型 就 是 針 刺 曲 霉 （A.spiculosus Blaser），兩個分支相似支持率較高。該真菌與散囊菌 屬 的E.chevalieri，E.amstelodami，E.herbariorum，E.cristatum等幾個近緣種聚在一起，并與序列EF652001聚為一個亞枝，支持率為80%。結合菌落特征與個體形態，可以確認此菌株為冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。

表1 構建系統發育樹所用序列及Genbank登錄號Table1 List of GenBank accession numbers used for construct phylogenetic tree

表2 煙葉發酵后理化分析檢測結果Table 2 Physical and chemical analysis of tobacco fermentation test results

圖 2 基于 rDNA ITS1－5.8S－ITS2 序列對 E.cristatum及一些相關種構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on analysis of rDNA ITS1－5.8S－ITS2 sequences of E.cristatum and some related species

2.4 煙葉發酵后理化檢測結果

經冠突散囊菌發酵后煙葉比空白對照的還原糖及水溶性總糖有所變化，總體呈增加趨勢，其中25℃，1×108和30℃，1×106的條件下發酵煙葉的還原糖及水溶性總糖變化幅度最大。發酵后，蛋白質含量與對照相比除個別有所升高，其余都有所下降，糖/堿比趨向于最佳比例10，氮/堿比更趨向于最適比例1。25℃，1×106條件下發酵煙葉煙堿含量降幅最大，而35℃，1×106條件下煙堿含量反而有所升高。經方差顯著性差異分析表明，溫度、接種濃度兩因素對煙堿含量變化影響不顯著，但冠突散囊菌能在一定程度上降低煙堿含量。表2中變化趨勢明顯的是石油醚浸提物，各個溫度下，與對照相比經冠突散囊菌發酵后的石油醚浸提物明顯下降，特別是25、30℃下各個樣品下降幅度較大，經方差顯著性差異分析表明，接種濃度對石油醚浸提物含量影響顯著，隨著接種濃度的增加，石油醚浸提物含量也隨之下降，可能原因是冠突散囊菌的介入影響作用。盡管石油醚提取物的含量常作為衡量煙葉品質和香氣的重要指標，但從其他指標總體分析說明冠突散囊菌對煙葉品質的改善有一定效果。

根據表3可以看出，與各溫度下空白對照相比，冠突散囊菌處理后的樣品在香氣質、香氣量、吸味上有很大改善，甜感增加，更加柔和，綜合評價較好。改善效果最明顯的是25℃，1×107和30℃，1×106兩個條件下發酵的樣品，總分都達到65分以上，吸味變得純凈舒適，結合表2，這兩個條件下發酵的樣品還原糖、水溶性多糖增加幅度也較大。值得關注的是，利用冠突散囊菌發酵處理后的樣品的雜氣、刺激性明顯改善，對總分的提高貢獻較大。經方差顯著性差異分析，溫度和接種量對評吸總分影響差異不顯著。綜合表2、表3，與對照樣品相比，冠突散囊菌對煙葉質量的改觀很明顯，可使香氣重要前體物質、還原性糖含量增加，煙堿不同程度的降低，使化學成分趨于協調平衡，雜氣減少、刺激性減輕，香氣外露，對煙葉品質的改善具有較明顯的促進作用，并形成獨特的煙質特點。

表3 煙葉發酵后感官評吸結果Table 3 Artificial smoking value of the tobacco after fermentation

3 結論與討論

25℃，接種濃度為1×107個/mL條件下的一個樣品發酵結束后顏色發生顯著變化，煙葉表面遍布大量黃色菌絲及冠突散囊菌閉囊殼，具獨特的菌花香，類似茯磚茶發出的“菌花”。經煙葉發酵后理化分析檢測及感官評吸結果顯示，這個樣品對應的糖含量、全鉀有所下降，各個化學成分及糖/堿比、氮/堿比變得更加協調。同時香氣質增加，吸味、雜氣刺激性改善明顯，總分較對照高，綜合評價好。說明冠突散囊菌能加速煙葉的發酵進程，降低有害物質，提高煙葉質量，且能產生誘香效應，形成獨特的香氣質。

外在添加有益微生物，要既能誘香，增加香氣，又能改善煙葉品質，達到降害作用，保證吸食安全性。冠突散囊菌能耐高滲透壓、高溫，抗逆性強，在發酵過程中對部分真菌、細菌和酵母的生長具有不同程度的抑制作用。文獻顯示，茯磚茶屬實際無毒物，傳統茯磚茶中冠突散囊菌未發現產毒明顯的菌株［15］。冠突散囊菌來自食品茶葉，應用于煙葉其安全性有所保證。煙葉醇化是生物、化學、環境等多因素協同作用的結果，本研究中溫、濕度的設定對結果影響不顯著，可進一步篩選出最適于冠突散囊菌生長且利于煙葉醇化的條件。

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