泡菜直投式乳酸菌發(fā)酵劑的制備

趙 爽，孫 娟，劉書亮，*，黃道梅，韓新鋒，顏正財

（1.四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川雅安 625014;2.四川吉香居食品有限公司，四川眉山 620039）

直投式發(fā)酵劑是不需活化和增殖而直接用于生產(chǎn)的一類新型發(fā)酵劑。其制備的一般過程是將離心后的高濃度菌泥添加凍干保護劑制成菌懸液，經(jīng)預凍后，在真空條件下升華干燥得到的干粉狀固體發(fā)酵劑，具有活菌含量高（109～1012cfu/g）、安全性好、保質(zhì)期長、使用方便、避免菌種退化等特點，適用于酸乳制品、泡菜等發(fā)酵食品，利于標準化生產(chǎn)。在泡菜發(fā)酵過程中，乳酸菌能快速產(chǎn)生大量乳酸及少量的細菌素、雙乙酰等抑菌性物質(zhì)［1－2］，能有效抑制雜菌、縮短發(fā)酵周期、降低亞硝酸鹽含量［3］。因此，直投式發(fā)酵劑在泡菜產(chǎn)業(yè)中具有廣闊的應用前景。

菌種的高密度培養(yǎng)、預凍條件、凍干保護劑的選擇等均是影響凍干存活率的關鍵因素［4－7］。國內(nèi)學者采用緩沖鹽法及化學中和法對乳酸菌進行高密度培養(yǎng)，菌懸液濃度一般未超過 109cfu/mL［8－10］。國外學者通過細胞循環(huán)培養(yǎng)法和透析法［11］明顯提高了細胞密度和產(chǎn)率，但其對設備和技術的要求較高。陸愛華［12］、朱東升等［13］發(fā)現(xiàn)，液氮預凍時，嗜酸乳桿菌的存活率比在普通預凍條件（－20℃）下高。大量研究表明，凍干主要損傷微生物細胞膜和敏感蛋白質(zhì)［14］。在凍干過程中，乳中的蛋白質(zhì)在菌體外形成蛋白衣［15］，起到保護乳酸菌的作用，同時它還可以固定凍干的酶類，防止由于細胞膜的損傷而導致胞內(nèi)物質(zhì)泄漏。Suree等［16］研究了凍干保護劑組合對乳酸乳球菌和乳桿菌凍干存活率的影響，相比單一保護劑，乳酸乳球菌和乳桿菌的活菌數(shù)分別增加11.69%～20.15%和 9.51%～18.15%。Diana 等［17］發(fā)現(xiàn)，當菌懸液細胞濃度從109cfu/mL增加到1010cfu/mL時，乳酸乳球菌的細胞存活率增加了1.7倍。近年來，泡菜專用乳酸菌發(fā)酵劑的研制及其應用是泡菜行業(yè)的熱門課題。2008年，陳功等［18］以5%麥芽糊精+5%蔗糖+0.8%海藻糖+0.2%吐溫作為凍干保護劑，得到植物乳桿菌的凍干存活率為80.6%、凍干菌粉活菌數(shù)為2.37×1010cfu/g，使用該直投式菌劑發(fā)酵青萊，得到的泡青菜產(chǎn)品香氣濃郁，酸度純正適中。2013年，王世寬等［19］采用響應面法優(yōu)化植物乳桿菌的凍干保護劑配方為脫脂奶粉7.06%、麥芽糖6.46%、谷氨酸鈉6.70%，其冷凍干燥存活率達到92.95%。上述資料顯示，不同種類乳酸菌存在一定差異性，因此篩選出不同種類乳酸菌的最適凍干條件具有重要意義。因此，本實驗旨在以優(yōu)良泡菜乳酸菌（戊糖片球菌PP與植物乳桿菌P158［20］）為對象，優(yōu)化其高密度培養(yǎng)條件、預凍條件及凍干保護劑配方，獲得高效的凍干菌劑，為泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生產(chǎn)泡菜的優(yōu)良菌種:產(chǎn)廣譜細菌素的植物乳桿菌P158（以下簡稱P158）、耐高鹽的戊糖片球菌PP（以下簡稱PP），均保存于四川農(nóng)業(yè)大學食品微生物實驗室。

培養(yǎng)基:改良MRS液體培養(yǎng)基見文獻［21］。

海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉、氫氧化鈉、乳糖、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼砂、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉，均為分析純;脫脂乳（市售）。

SW－CJ－1F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;UV－3200（PC）紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;真空冷凍干燥機 Thermo Power Dry PL3000，F(xiàn)reeze Dryer;超低溫冷凍冰箱 Thermo Forma－86c ULT Freezer;液氮罐 成都鈞喬科技有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株PP、P158生長曲線的測定 將兩株甘油保存的實驗菌株，劃線接種于MRS平板，30℃培養(yǎng)48h，挑取單菌落，劃線接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，然后從斜面用接種環(huán)挑取3～5環(huán)接種于10mL液體MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h，即得種子液。將菌株PP、P158分別接種于液體MRS培養(yǎng)基，接種量3%（v/v），30℃培養(yǎng)。0～12h每隔2h取樣，12～48h每隔4h取樣，測定培養(yǎng)液pH及OD600值，繪制生長曲線，確定細胞收獲期。

1.2.2 培養(yǎng)方式的選擇

1.2.2.1 補料方式的確定 將培養(yǎng)基中所有碳氮源按原有比例混勻后看作一個整體，設其在培養(yǎng)基中含量為x。

補料方式A:以MRS培養(yǎng)基作為對照，不補料。

補料方式B:以碳氮源含量為0.5x的MRS培養(yǎng)基為基礎，接種菌株進行培養(yǎng)，在對數(shù)生長中期補加碳氮源0.5x。

補料方式C:以碳氮源含量為x的MRS培養(yǎng)基為基礎，接種菌株進行培養(yǎng)，在對數(shù)生長期末期補料0.5x。

對于3種補料培養(yǎng)方式，從進入對數(shù)期的前2h開始，每隔4h測定培養(yǎng)液的OD600值，直到所測OD600值基本穩(wěn)定，繪制補料生長曲線;同時，測定乳酸菌活菌數(shù)。

1.2.2.2 等pH培養(yǎng) 在菌株培養(yǎng)過程中，每隔4h，通過滴加20%Na2CO3調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH，使其在培養(yǎng)過程中維持在6.2～6.4之間，同時測定培養(yǎng)液的OD600值，直到pH穩(wěn)定甚至開始增大時，繪制等pH培養(yǎng)的生長曲線;以未調(diào)pH的為對照組。

1.2.2.3 驗證實驗 按篩選出的最適高密度培養(yǎng)條件對菌株PP和P158進行培養(yǎng)，并在菌濃度最高時計培養(yǎng)液的活菌數(shù)，以未補料、未調(diào)pH的培養(yǎng)方式作為對照組。

1.2.3 凍干條件的選擇

1.2.3.1 預凍溫度和時間的選擇 以10%的脫脂乳作為基礎凍干保護劑，115℃高壓蒸汽滅菌15min。分別將制備好的菌懸液置于－76℃超低溫冰箱預凍1、1.5、2h 或液氮中預凍 5、10、15min;預凍后，迅速轉移至凍干機樣品架，凍干12h。以凍干存活率為指標，篩選出最適的預凍溫度和時間。

1.2.3.2 凍干保護劑的選擇 在文獻［18－19，22］及預實驗的基礎上，以10%的脫脂乳作為基礎凍干保護劑，選取海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉進行正交實驗，懸浮于10%的脫脂乳作為保護劑。將海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉分別按表1中比例添加到基礎凍干保護劑中混勻，115℃滅菌15min［23］，冷卻至室溫待用。按正交實驗設計添加凍干保護劑制成菌懸液后，最適預凍條件下進行預凍。以凍干存活率為指標，篩選出最適的凍干保護劑配方。

表1 保護劑正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of protectant orthogonal experiment

1.2.3.3 驗證實驗 菌株PP和P158按1.2.2優(yōu)化出的高密度培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，添加最佳凍干保護劑組合，在最適預凍溫度和時間進行凍干，測定其凍干前、后最高活菌數(shù)及凍干存活率。

1.2.4 發(fā)酵劑的應用實驗 將制備好的發(fā)酵劑應用于什錦泡菜發(fā)酵，以胡蘿卜、白蘿卜、萵筍、小紅椒、芹菜（16∶16∶16∶1∶1）為原料，將處理好的蔬菜條按1.5kg/壇分裝于泡菜壇中，按1∶1加入水（含鹽4%、糖3%，按菜水總重計），并按泡菜總重的0.05%添加發(fā)酵劑（戊糖片球菌∶植物乳桿菌=1∶1），同時以只添加25%老鹽水發(fā)酵和不添加發(fā)酵劑不添加老鹽水的自然發(fā)酵為對照組。對三種發(fā)酵方式發(fā)酵的泡菜產(chǎn)品進行感官評價，并測定其亞硝酸鹽含量。

1.2.4.1 指標的測定方法 菌懸液濃度的測定:紫外分光光度法測定菌懸液在600nm處的OD值。

乳酸菌活菌數(shù)測定:平板培養(yǎng)計數(shù)法。

凍干存活率的測定:用平板培養(yǎng)計數(shù)法分別測定凍干前、后的活菌數(shù)，計算凍干存活率。凍干前活菌數(shù)即菌懸液中的活菌數(shù);凍干后活菌數(shù)為凍干菌粉在室溫條件下懸浮于20%的乳糖溶液中30min，恢復活性后的活菌數(shù)。

凍干存活率（%）=凍干后1mL菌懸液中活菌數(shù)/凍干前1mL菌懸液中活菌數(shù)×100

感官評價:參照文獻［24］表1的評價標準，由10人組成的評價小組對產(chǎn)品的形態(tài)、色澤、氣味、口感和脆度五個方面進行感官評價，對應的評價得分集={很差（2），較差（4），一般（6），較好（8），很好（10）}，評價結果用SPSS軟件進行分析。

亞硝酸鹽的測定:鹽酸萘乙二胺法，參照GB/T5009.33－2010。

2 結果與分析

2.1 菌種在MRS培養(yǎng)基中的生長曲線

以MRS為培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30℃，接種量3%，菌株PP和P158的pH和OD值隨時間變化的生長曲線如圖1所示，0～2h，OD值呈緩慢上升趨勢，2h后，OD值急劇上升，達到峰值后逐漸趨于穩(wěn)定;pH的變化是先緩慢下降，然后急劇下降，最后趨于穩(wěn)定。OD值和pH的變化說明，兩株菌株在改良MRS培養(yǎng)基中經(jīng)過了大約2h的延遲適應期后，開始進入對數(shù)生長期，達到峰值后即進入穩(wěn)定期。其中，PP的對數(shù)生長期約為2～24h，P158的對數(shù)生長期約為2～18h。

2.2 高密度培養(yǎng)條件的確定

2.2.1 補料方式的確定 由圖1生長曲線確定補料方式B的補加時間為對數(shù)生長期中期，即菌株PP為13h，P158為10h;補料方式C的補加時間為對數(shù)生長期末期，即菌株PP為22h，P158為16h。

由圖2可知，補料方式B整個過程中OD值低于補料方式A，補料方式C在前期與補料方式A相當，之后高于補料方式A。表明菌株PP和P158在生長后期由于底物消耗、營養(yǎng)不足受到限制，補料后菌株生長情況得到明顯改善。通過補料培養(yǎng)，菌株PP的最高活菌數(shù)為5.23×109cfu/mL，菌株P158可達1.24×1010cfu/mL，均比常規(guī)培養(yǎng)提高了約13%。

圖1 菌株PP、P158生長曲線Fig.1 Growth curve of strain PP and P158

圖2 菌株PP、P158補料生長曲線Fig.2 Feeding curve of strain PP and P158

2.2.2 等pH培養(yǎng)結果 調(diào)節(jié)pH，主要是中和乳酸菌的代謝產(chǎn)物乳酸，從而解除對其生長的抑制，獲得高濃度的菌液。由圖3可知，在4～16h之間，等pH培養(yǎng)的菌株PP和P158的生長情況均明顯高于對照組，說明調(diào)節(jié)pH可有效解除代謝產(chǎn)物乳酸對菌體生長的抑制。16～32h之間，菌株PP的生長情況為實驗組與對照組相當，而菌株P158依然是實驗組明顯高于對照組。通過等pH培養(yǎng)，戊糖片球菌PP的最高活菌數(shù)為8.42×109cfu/mL，植物乳桿菌P158可達2.00×1010cfu/mL，比常規(guī)培養(yǎng)提高了約82%。

圖3 菌株PP、P158等pH培養(yǎng)曲線Fig.3 Growing curve of strain PP and P158 with a stable pH

2.2.3 驗證實驗結果 菌株PP接種于改良MRS培養(yǎng)基中，每隔4h調(diào)pH使之維持在6.2～6.4之間，培養(yǎng)至22h時補加0.5x的碳氮源，培養(yǎng)至26h收獲菌體，測定其活菌數(shù)為9.01×109cfu/mL，比對照組（4.63×109cfu/mL）提高約95%。

表2 不同預凍條件下的凍干存活率Table 2 Freeze－drying survival rate in different frozen condition

菌株P158接種于改良MRS培養(yǎng)基中，每隔4h調(diào)pH使之維持在6.2～6.4之間，培養(yǎng)至16h時補加0.5x的碳氮源，培養(yǎng)至20h收獲菌體，測定其活菌數(shù)為2.14×1010cfu/mL，比對照組（1.10×1010cfu/mL）提高約95%。

2.3 乳酸菌發(fā)酵劑凍干條件的篩選結果

2.3.1 預凍溫度和時間的確定 六種預凍條件下，菌株的凍干存活率見表2。可以看出，菌株PP、P158的最適預凍方式均為液氮15min。其中，菌株PP的凍干存活率可達90.00%，而P158僅有67.00%。在同一溫度下，菌株PP受時間影響比P158更為明顯。

2.3.2 凍干保護劑的確定 由表3至表6可知，三種保護劑對菌株PP和P158的極差R的大小順序為:海藻糖＞蔗糖＞谷氨酸鈉，極差越大表明該因素對結果的影響越顯著，因此三種保護劑對菌株PP和P158凍干存活率的影響的主次順序依次均為:海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉;由F值可知，海藻糖、蔗糖對菌株PP和P158凍干存活率的影響極顯著，谷氨酸鈉對菌株PP和P158凍干存活率影響顯著;由k值可知，戊糖片球菌PP各因素的最佳組合為A3B3C1，即海藻糖7%，蔗糖7%，谷氨酸鈉3%;植物乳桿菌P158各因素的最佳組合為A3B3C2，即海藻糖7%，蔗糖7%、谷氨酸鈉5%。

表3 戊糖片球菌PP凍干保護劑正交實驗結果Table 3 Cryoprotectants orthogonal experimental results of Pediococcus pentosaceus PP

表4 方差分析結果Table 4 Results of variance analysis

2.3.3 凍干條件驗證結果 戊糖片球菌PP以A3B3C1為凍干保護劑進行凍干后，測得其凍干存活率為95.80%，高于所有正交實驗組的存活率，凍干劑的活菌數(shù)約為6.43×1010cfu/g。

表5 植物乳桿菌P158凍干保護劑正交實驗結果Table 5 Cryoprotectants orthogonal experimental results of L.plantarum P158

表6 方差分析結果Table 6 Results of variance analysis

植物乳桿菌P158以A3B3C2為凍干保護劑進行凍干后，測得其凍干存活率為75.60%，高于所有正交實驗組的存活率，凍干菌劑的活菌數(shù)約為7.32×1011cfu/g。

2.4 泡菜產(chǎn)品的指標測定結果

當pH下降至3.6時，結合泡菜色澤、口感等確定發(fā)酵終點。發(fā)酵劑發(fā)酵48h（pH降至3.51），發(fā)酵成熟;泡菜老鹽水發(fā)酵48h（pH降至3.54），發(fā)酵成熟;自然發(fā)酵成熟時間為72h。

2.4.1 感官評價結果 從感官評價結果看，發(fā)酵劑發(fā)酵的總得分最高，老鹽水發(fā)酵居中，自然發(fā)酵效果最差;發(fā)酵劑發(fā)酵的泡菜在整個發(fā)酵過程中，泡菜維持應有的色澤，發(fā)酵液清亮，伴有清香氣味，咀嚼脆性較好;發(fā)酵劑發(fā)酵泡菜在色澤方面與泡菜老鹽水發(fā)酵泡菜相當，但在嗅覺、口感、脆度方面優(yōu)于老鹽水發(fā)酵泡菜。

表7 三種發(fā)酵方式泡菜感官評價結果Table 7 Results of sensory evaluation for the 3 kinds of pickles

2.4.2 泡菜產(chǎn)品的亞硝酸鹽含量的比較 由圖4可知，自然發(fā)酵所得泡菜在發(fā)酵24h后，亞硝酸鹽含量迅速升高，發(fā)酵60h時，其含量為12.11mg/kg，是發(fā)酵劑發(fā)酵泡菜含量8倍;發(fā)酵劑發(fā)酵泡菜在發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量最高為1.51mg/kg，泡菜老鹽水發(fā)酵泡菜最高為2.80mg/kg。

圖4 泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.4 Changes of concentration of nitrite during pickle fermentation

3 結論

3.1 經(jīng)高密度培養(yǎng)后，菌株PP的活菌數(shù)明顯低于菌株P158，但凍干后其凍干存活率卻明顯高于菌株P158，可見，不同菌種的生理特性也是影響高密度培養(yǎng)及凍干存活率的重要因素。

3.2 在最適培養(yǎng)方式、預凍及凍干條件下，菌株PP凍干保護劑為海藻糖7%，蔗糖7%，谷氨酸鈉3%，菌株P158凍干保護劑為海藻糖7%，蔗糖7%、谷氨酸鈉5%;菌株PP與P158凍干菌劑活菌數(shù)分別達到6.43×1010cfu/g與7.32×1011cfu/g，凍干存活率分別為95.80%和75.60%，明顯高于賀稚非［9］等以10%脫脂牛乳和血清蛋白為保護劑、陳功［22］等以5%麥芽糊精+5%蔗糖+0.8%海藻糖+0.2%吐溫作為凍干保護劑制成的泡菜乳酸菌發(fā)酵劑。

3.3 添加發(fā)酵劑（戊糖片球菌∶植物乳桿菌=1∶1）制成的泡菜產(chǎn)品，具有亞硝酸鹽含量低及優(yōu)良感官品質(zhì)的特點，能明顯提高泡菜產(chǎn)品品質(zhì)與安全。

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