費菜總黃酮分離純化工藝的研究

胡 月，王鴻飛，劉 飛，許 鳳，邵興鋒，李和生

（寧波大學食品科學與工程系，浙江寧波 315211）

費菜（Sedum aizoon L.）景天科景天屬，多年生肉質草本植物，主產于四川、湖北、浙江、江蘇、山東等地。功效類三七，故別名景天三七、養心草、救心菜、土人參等［1－2］。費菜有擴張動脈血管，興奮心臟，解毒、降壓、鎮靜、活血止血、安靜定氣等作用［3］，被稱為善治心血管病的費菜。近些年來，費菜中主要含有黃酮類、生物堿、甾醇等活性成分。黃酮類物質具有保護人體心腦血管，促進血液循環的功效，對人類腫瘤、心血管等疾病的預防和治療具有重要意義［4－5］。

目前，對于費菜中總黃酮的分離純化工藝的系統研究還比較少見，因此為了開發利用費菜資源，本文根據文獻報道，采用AB－8大孔吸附樹脂對費菜葉總黃酮進行分離純化。大孔樹脂具有選擇性好、理化性質較穩定、對提取物污染小等優點，且其易于提取，相對于其他分離技術，該方法效率高、穩定性好及容易再生，因而近幾年多種植物的黃酮類化合物的分離純化中被廣泛應用［6－7］。

本實驗分別選用靜態實驗和動態實驗考察大孔樹脂對費菜總黃酮分離純化的效果以及影響因素，研究探討費菜葉總黃酮分離純化的最佳工藝條件和最佳影響因素，以期為費菜葉總黃酮在生產中最有效的開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

費菜 全草均采自江蘇沛縣野生蔬菜研究所張寨示范園，采用統一干燥方法加工制樣，避免背景干擾;所用試劑無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、結晶三氯化鋁 均為分析純;對照品蘆丁 純度大于95%;AB－8型大孔吸附樹脂 天津南開大學化工廠。

Cary 50 Scan紫外分光光度計 美國瓦里安技術中國有限公司;Orion 420A+酸度計 美國Thermo公司;DKY－Ⅱ恒溫調速回轉式搖床 上海杜科自動化設備有限公司;SB3200D型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;WK－200B型高速藥物粉碎機 山東青州市精誠機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大孔樹脂的預處理 將樹脂用95%乙醇溶液浸泡24h，使其充分溶脹后用濕法裝柱，再用95%乙醇洗脫，檢查乙醇流出液，至乙醇－水（1∶1）流出液不呈白色混濁為止，后再用大量蒸餾水洗至無醇味。再進行酸堿處理，加入4%鹽酸溶液浸泡12h，用蒸餾水洗至中性，再加入4%氫氧化鈉溶液浸泡12h，后用蒸餾水洗至中性，取出樹脂備用。

1.2.2 費菜總黃酮上柱樣品液的制備 費菜烘干粉碎過80目篩后，用L9（34）正交設計篩選出的乙醇超聲波提取費菜黃酮的最佳水平組合工藝:即采用超聲時間50min，90%乙醇溶液，料液比1∶50，乙醇浸提pH9，浸提溫度60℃，浸提6h，制得費菜總黃酮提取液（0.9mg/mL）冷藏備用［8］。

1.2.3 費菜總黃酮含量測定

1.2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取24.4mg蘆丁置于100mL容量瓶中，加30%乙醇稍加熱溶解，冷卻并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3.2 標準曲線制備 分別吸取0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mL于 10mL比色管中，再加入 2% 的AlCl3溶液1mL，用30%乙醇溶液定容，靜置20min，于275nm波長處測定各濃度吸光度，繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.2.4 AB－8大孔樹脂靜態吸附解吸實驗

1.2.4.1 靜態吸附量、吸附率和解析率的測定 準確稱取已處理的樹脂2g于150mL錐形瓶中，精密加入40mL費菜總黃酮提取液，置于25℃恒溫振蕩器中振蕩24h（120r/min），待其充分吸附后，按1.2.3紫外分光光度法測定溶液中費菜總黃酮的濃度。按下式計算AB－8大孔樹脂的吸附量和吸附率:

式中:Q為吸附量（mg/g）;C0為吸附前費菜總黃酮濃度（mg/mL）;Cr為吸附后濃度（mg/mL）;V為費菜總黃酮溶液體積（mL）;m為樹脂質量（g）;P為吸附率（%）;

取充分吸附后的樹脂抽濾，再用蒸餾水洗去殘液，精密加入40mL的70%乙醇溶液，置于25℃的恒溫振蕩器中以120r/min振蕩24h，按1.2.3紫外分光光度法測定溶液中費菜總黃酮的濃度。按下式計算AB－8大孔樹脂的解析率:

式中:D為解析率（%）;Cd為解析液中總黃酮濃度（mg/mL）;Vd為解析液體積。

1.2.4.2 pH對AB－8大孔樹脂吸附量的影響 準確稱取已處理好樹脂各6份，每份2g于150mL錐形瓶中，精密加入 pH 為 3、4、5、6、7、8 費菜總黃酮溶液，置于25℃的恒溫振蕩器中以120r/min振蕩24h，使其充分吸附，吸取其上清液測定費菜總黃酮濃度，按1.2.4.1中的（1）式計算吸附量。

1.2.4.3 洗脫劑濃度對解析率的影響 準確稱取已處理好樹脂各5份，每份2g于150mL錐形瓶中，精密加入40mL費菜總黃酮溶液，pH為5，置于25℃恒溫振蕩器中以120r/min振蕩24h，使其達到飽和吸附，將樹脂抽濾后，對應加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液40mL，再將其置于25℃恒溫振蕩器中以120r/min振蕩24h，待其充分洗脫后取上層液測定費菜總黃酮濃度，按1.2.4.1中的公式（3）計算解析率。

1.2.4.4 洗脫時間對解析率的影響 準確稱取已處理好樹脂各5份，每份2g于150mL錐形瓶中，精密加入40mL費菜總黃酮溶液，置于25℃恒溫振蕩器中以120r/min振蕩24h，使其達到飽和吸附，將樹脂抽濾后，加入80%乙醇溶液40mL，再將其置于25℃恒溫振蕩器中振蕩，每隔一段時間測定其上層液中費菜總黃酮的濃度，按1.2.4.1中的公式（3）計算其解析率。

1.2.4.5 樹脂對費菜總黃酮的靜態吸附動力學曲線準確稱取已處理樹脂2g于150mL錐型瓶中，精密加入費菜總黃酮提取液40mL于25℃恒溫振蕩器中以120r/min振蕩24h，每隔一定時間取吸附余液測定其總黃酮濃度，繪制費菜總黃酮靜態吸附動力學曲線。

1.2.5 AB－8大孔樹脂的動態吸附和洗脫性能實驗

1.2.5.1 吸附流速對動態吸附性能的影響 準確稱取已處理好樹脂各3份，濕法裝入10×200mm色層分析柱中，將0.35mg/mL費菜總黃酮溶液以1、2、3mL/min的體積流量進行動態吸附，收集流出液中費菜總黃酮濃度（以原液濃度10%的流出液總黃酮濃度為泄漏點）。

1.2.5.2 洗脫流速對樹脂動態解析性能的影響 準確稱取已處理好樹脂各3份，濕法裝入10×200mm色層分析柱中，將0.35mg/mL費菜總黃酮溶液以1mL/min的體積流量進行動態吸附，以2mL/min的速度用蒸餾水洗脫至無色。以1.2.4.3中已確定的80%乙醇溶液為洗脫劑，分別以1、2、3mL/min的體積流量進行吸附，考察對動態吸附性能的影響。

1.2.5.3 洗脫劑用量的確定 取5g經預處理的AB－8大孔樹脂濕法裝柱，以1mL/min的速度上樣，用2mL/min的蒸餾水洗脫。再以3mL/min的速度，用80%乙醇溶液進行洗脫，分步收集洗脫液，測定費菜總黃酮濃度以濃度為零和洗脫液無色為終點，繪制洗脫曲線，確定最佳用量。

1.2.5.4 洗脫蒸餾水用量的確定 取5g經預處理的AB－8大孔樹脂濕法裝柱，以1mL/min的速度上樣，用2mL/min的蒸餾水洗脫。分步收集洗脫液，繪制洗脫曲線，確定蒸餾水最佳用量。

1.2.5.5 樹脂對費菜總黃酮的動態吸附動力學曲線 取5g經預處理的AB－8大孔樹脂濕法裝柱，以1mL/min的速度將一定量濃度的0.37mg/mL的費菜總黃酮溶液上樣，分段收集，每5min收集一份，測定其中費菜總黃酮濃度，繪制動態吸附曲線。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

根據1.2.3.2中的蘆丁標準曲線制備方法，繪制標準曲線，計算回歸方程:

其中X為費菜總黃酮濃度，Y為吸光度。

所得標準曲線如圖1所示:

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 AB－8大孔樹脂對費菜總黃酮靜態吸附解吸優化

2.2.1 pH對AB－8大孔樹脂吸附量的影響 不同pH條件下AB－8樹脂對費菜總黃酮的吸附程度不同。由圖2可知，pH為5時費菜總黃酮的吸附率可達到最大值，吸附效果好，因為黃酮類物質為多羥基酚類，在弱酸或者酸性條件下有較好的吸附效果。如圖所示，當pH大于5時，隨pH增加，吸附量下降。

圖2 樣品pH對總黃酮吸附量的影響Fig.2 Effects of the sample pH on the adsorption of the resin

2.2.2 洗脫劑濃度對解析率的影響 由圖3可知:隨著乙醇濃度的升高，費菜黃酮解析率也逐漸增大，但當乙醇濃度大于80%時，解析率逐漸減小，說明費菜黃酮已洗脫完全，所以80%乙醇為最佳洗脫劑濃度。

2.2.3 洗脫時間對解析率的影響 由圖4可知:解析率隨著時間的延長不斷升高，達到20h后，解析率達到較高值且增加緩慢，到24h時已達到95%，說明洗脫24h后使得費菜黃酮基本洗脫完，可以確定洗脫時間為24h。

圖3 乙醇濃度對解析率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on the desorption ratio

圖4 洗脫時間對解析率的影響Fig.4 Effects of time on the desorption ratio

2.2.4 靜態吸附動力學曲線 由圖5可以看出，大孔樹脂對費菜總黃酮的吸附量隨著時間的增加而增加，當吸附時間達到24h后，吸附量不再增加，趨于平緩，說明AB－8大孔樹脂對費菜總黃酮的吸附量已經達到飽和，而當吸附時間達到6h時，吸附量已增加緩慢，所以，從生產成本這個角度，6h為最適宜的飽和吸附時間。

圖5 靜態吸附動力學曲線Fig.5 Changes of adsorption capacity of resin along with the time

2.3 AB－8大孔樹脂的動態吸附和洗脫性能優化

2.3.1 吸附流速的確定 從圖6可以看出，以1、2、3mL/min的吸附流速，當流出液中總黃酮濃度為原液濃度的10%時，時間分別是15、10、7min;當流速增大時，提取液中的黃酮分子會與樹脂接觸不充分［8］，導致吸附量較低，所以流速越小時黃酮與樹脂可以接觸越充分，而吸附流速太小，會導致經濟與時間的浪費，循環周期延長。因此，選擇吸附流速為1～2mL/min為宜。

圖6 吸附流速對樹脂動態吸附的影響Fig.6 Effects of velocities of the sample on the dynamic adsorption of resin

2.3.2 洗脫流速的確定 從圖7可以看出，洗脫流速為3mL/min時洗脫效果最好，得到的峰形最窄，峰值最高，2mL/min次之，洗脫效果較好，而1mL/min得到的峰形最寬，峰值最低。但是當洗脫流速越快時，洗脫劑與樹脂的接觸就越不充分，所以選擇洗脫流速為2mL/min較適宜。

圖7 洗脫流速對解析性能的影響Fig.7 Effects of velocities of the elute on the efficient of desorption

2.3.3 洗脫劑用量的確定 圖8表明，以80%乙醇為洗脫劑時，用量為20mL的費菜總黃酮濃度最高，超過20mL后濃度逐步降低，到100mL后洗脫液澄清至無色，費菜總黃酮濃度為零。當洗脫劑用量過多時，不僅造成洗脫劑的浪費，而且大大增加洗脫時間。但是當洗脫劑用量過少又會影響生產循環周期。所以，以洗脫劑體積計，最佳用量為80%乙醇，2mL/min流速，80mL為最佳用量。

圖8 洗脫劑體積的確定Fig.8 Determination of the volume of the eluent

2.3.4 洗脫蒸餾水用量的確定 蒸餾水以2mL/min的流速洗脫，蒸餾水可以洗去多余雜質［9］。由圖9可知，當蒸餾水用量為20mL時，洗脫液中費菜總黃酮的濃度最高，說明大部分的費菜總黃酮殘余液已經被洗去。為了將殘余液洗脫盡，蒸餾水用量為150mL為宜，但是蒸餾水用量過多，會對已吸附的費菜黃酮造成損失，所以選擇蒸餾水用量100mL為最佳。

圖9 蒸餾水體積的確定Fig.9 Determinstion of the volume of distilled water

2.3.5 AB－8大孔樹脂對費菜總黃酮的動態吸附動力學曲線 從圖10可知，AB－8大孔樹脂對費菜總黃酮的吸附隨著時間的延長，費菜總黃酮濃度逐步增長，約15～20min時流出液濃度可達到原液濃度的10%，20min后到40min之間費菜總黃酮濃度增長迅速，120min之后樹脂吸附基本平衡，流出液中總黃酮濃度變化緩慢。以上結果表明，AB－8大孔樹脂對費菜總黃酮的吸附動力學效果良好，選擇該樹脂作為本文實驗樹脂較適合。

圖10 動態吸附曲線Fig.10 The curve of the dynamic adsorption of resin

2.4 費菜總黃酮分離純化前后結果

收集解析液，利用旋轉蒸發儀回收乙醇得到濃縮液，將濃縮液真空冷凍干燥得到費菜總黃酮干粉。稱量一定量的干粉用30%乙醇定容，按照紫外分光光度法測定費菜總黃酮的含量，計算得到費菜總黃酮的純度為47.98%。

3 結論

AB－8大孔樹脂屬于極性樹脂，黃酮類化合物因其具有酚羥基以及糖苷鍵等極性結構［10］，所以費菜總黃酮的分離純化適宜采用AB－8大孔樹脂。

本實驗也表明，AB－8大孔樹脂對費菜總黃酮有較好的靜態吸附－洗脫效果，飽和吸附量為11mg/g，吸附率為68.3%，解析率為94.5%。

目前，尚未報道費菜總黃酮分離純化的最優工藝。本研究采用AB－8大孔樹脂對費菜總黃酮進行分離純化，得到最佳的純化工藝為上樣液pH5.0洗脫劑濃度80%乙醇，洗脫時間24h，上樣流速1mL/min，吸附流速1～2mL/min，洗脫流速2mL/min，吸附時間120min，洗脫用蒸餾水體積 100mL，洗脫劑用量80mL。所以本實驗對AB－8大孔樹脂分離純化費菜總黃酮進行了系統的工藝研究，所優選的純化工藝較合理、可行，以期為費菜總黃酮的工業化奠定理論基礎。

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