響應面法優(yōu)化金銀花多糖乙酰化工藝

宋 逍，辛亞洲，趙 鵬，張婷婷，王昌利

（陜西中醫(yī)學院，陜西咸陽 712046）

金銀花（Lonicera japonica）是忍冬科植物忍冬的干燥花蕊，其主要分布于我國的山東、河北、陜西等省。金銀花是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，主要具有清熱解毒、涼散風熱、抗病毒等功效，在臨床上可用于治療丹毒、喉痹、熱毒血痢、風熱感冒等疾病［1－2］。研究表明，金銀花多糖是金銀花中的主要活性成分之一，具有較好的抗氧化、抗菌、提高免疫力等生物活性［3－5］。目前對于金銀花多糖的研究主要集中其分離純化、藥理活性等方面［6－10］，而對其結構進行衍生化方面的研究尚未見報道。

對于多糖進行衍生化的方法主要包括物理法、化學法及生物法等。利用化學的方法對多糖的分子結構進行修飾，能夠提高其生物活性，甚至賦予其新的生物活性。正因為如此，對于多糖的衍生化研究已成為多糖研究者重點關注的熱點之一［11－14］。

本研究在前期對金銀花多糖分離純化的研究基礎之上，利用響應面法對金銀花多糖乙?；揎椀暮铣晒に嚄l件進行了優(yōu)化研究，并初步研究了乙?；蠖嗵堑目寡趸裕疾煲阴；揎棇疸y花多糖抗氧化活性的影響。以期為把金銀花多糖及其乙?；苌镩_發(fā)成為新型、安全、天然的藥品、功能性食品添加劑提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花 購自西安萬壽路中藥材批發(fā)市場;乙酸酐、鹽酸羥胺、乙醇、乙醚、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚、鄰二氮菲、氨基丁三醇、β－D－五乙酰葡萄糖標準品及其它試劑 均為國產分析純。

UV－2501PC紫外可見分光光度儀 日本島津公司;FA2004電子天平 上海精科天平廠;H2050R臺式離心機 湖南湘儀公司;ALPHA1－4型真空冷凍干燥機 德國CHRIST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金銀花多糖的制備 將金銀花在80℃下干燥，粉碎后過60目篩。再將其用無水乙醇在回流下脫脂兩次，過濾，濾渣晾干后，用雙蒸水，按料液比1∶15（g/mL）80℃下提取2次，提取液合并，再按1g生藥材濃縮為1mL進行濃縮，濃縮液經脫蛋白、脫色處理后醇沉，即得金銀花粗多糖，用水復溶后，再用Sephadex G－200凝膠柱進行純化，收集多糖富集峰，濃縮后凍干即得金銀花多糖，經測定該多糖含量為95.2%，經高效凝膠色譜法檢測，其為均一多糖，分子量為31.3Ku。

1.2.2 金銀花多糖的乙酰化 參照文獻的方法［11］，先精確稱取一定量的多糖樣品，加入適量雙蒸水將其溶解，利用氫氧化鈉調節(jié)反應液的pH在9.0左右，在一定溫度下，往多糖溶液滴加一定量的乙酸酐。滴加完畢后，恒溫反應一段時間后，待反應結束，再用鹽酸溶液將反應液調為中性。將反應液裝入截留分子量為3500的透析袋中用流動水透析48h。透析液濃縮后即得乙?；揎椀慕疸y花多糖。

1.2.3 金銀花多糖乙?；に噯我蛩赜绊?/p>

1.2.3.1 反應溫度對金銀花多糖乙?；〈鹊挠绊?采用0.1g金銀花多糖，固定反應時間為4.0h，乙酸酐與多糖的摩爾投料比為2.0，分別考察了50、60、70、80和90℃五個反應溫度下的反應過程，測定不同產物的乙酰化取代度，確定最優(yōu)的反應溫度。

1.2.3.2 配料比對金銀花多糖乙?；〈鹊挠绊懖捎?.1g金銀花多糖，固定反應時間為4.0h，反應溫度70℃，分別考察了1.0、1.5、2.0、2.5和3.0五個配料比下的反應過程，測定不同產物的乙?；〈?，確定最優(yōu)的配料比。

1.2.3.3 反應時間對金銀花多糖乙?；〈鹊挠绊?采用0.1g金銀花多糖，固定乙酸酐與多糖的摩爾投料比為2.0，反應溫度70℃，分別考察了1.0、2.0、3.0、4.0和5.0h五個反應時間下的反應過程，測定不同產物的乙?；〈?，確定最優(yōu)的反應時間。

1.2.4 金銀花多糖乙?；に嚄l件優(yōu)化 本研究按照Box－Benhnken的中心組合實驗設計原理，在單因素實驗的基礎之上，以鐵含量為響應值，選取反應時間、配料比（乙酸酐與多糖的摩爾比）和反應溫度等三個對反應具有較大影響的單因素進行響應面實驗，來優(yōu)化金銀花多糖乙酰化的工藝條件。實驗因素和水平設計如表1所示。

表1 實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the designed experiment

1.2.5 金銀花多糖乙酰化取代度的測定 參照文獻［15］，采用羥胺比色法測定乙?；疸y花多糖的取代度。

1.2.6 抗氧化性能測試 參照文獻［16］測試樣品對超氧陰離子和羥自由基的清除效果。

2 結果與討論

2.1 金銀花多糖乙酰化的合成

2.1.1 單因素分析

2.1.1.1 反應溫度對金銀花多糖乙?；〈鹊挠绊?反應溫度對金銀花多糖乙酰化取代度的影響結果見圖1。圖1所示的結果說明，當反應溫度在50～70℃時，多糖乙?；〈鹊闹抵饾u增大，70℃達到最大，隨后隨著溫度的升高，取代度又出現了下降趨勢，從多糖的取代度及穩(wěn)定性考慮，確定最優(yōu)的反應溫度為70℃左右。

圖1 反應溫度對金銀花多糖乙?；〈鹊挠绊慒ig.1 Effects of reaction temperature on DS of Lonicera japonica polysaccharides

2.1.1.2 配料比對金銀花多糖乙?；〈鹊挠绊?配料比對金銀花多糖乙?；〈鹊挠绊懡Y果見圖2。圖2所示的結果說明，當配料比在1.0～2.0時，多糖乙?；〈鹊闹悼焖僭龃?，2.0左右時達到最大，隨后隨著配料比的增加，取代度趨于平緩，因此確定最優(yōu)的配料比為2.0左右。

圖2 配料比對金銀花乙酰化取代度的影響Fig.2 Effects of polysaccharides－to－acetic anhydride ratio on DS of Lonicera japonica polysaccharides

2.1.1.3 反應時間對金銀花多糖乙?；〈鹊挠绊?反應時間對金銀花多糖乙?；〈鹊挠绊懡Y果見圖3。圖3所示的結果說明，當反應時間為1.0～3.0h時，多糖乙酰化取代度的值快速增大，3.0～4.0h時逐漸變緩，4.0h以上，又逐漸下降，從多糖的取代度及穩(wěn)定性考慮，因此確定最優(yōu)的反應時間為3.0～5.0h之間。

圖3 反應時間對金銀花乙?；〈鹊挠绊慒ig.3 Effects of reaction time on DS of Lonicera japonica polysaccharides

2.1.2 金銀花多糖乙?；揎椆に嚄l件優(yōu)化 響應面得到的實驗及分析結果如表2和表3所示。

表2 響應面分析實驗方案及實驗結果Table 2 Program and test results of RSM

采用Design－Expert 7.01軟件對響應面優(yōu)化實驗得到的結果進行分析研究，實驗結果見表2，按照各因素對實驗結果的影響進行二次方程擬合，擬合得到下式:

由方差分析表3的分析結果可以看出，回歸方程的F值為115.97，p＜0.0001，且失擬誤差的p值為0.0919，不顯著，這說明利用響應面法擬合得到的實驗模型極顯著，按照擬合模型得到的回歸方程，考察其因變量與自變量之間的線性相關系數后發(fā)現，r=0.051/0.051=1.0000，這一點表明用該數學模型來評估各相關因素對金銀花多糖乙?；〈鹊挠绊懣尚胖递^高。對表3的方差分析結果可以看出，響應面實驗組合的反應溫度和配料比對金銀花多糖乙?；〈鹊挠绊懢鶚O顯著，反應時間為顯著影響因素，其中影響最大的是配料比，其次是反應溫度，反應時間的影響最小，在交互影響因素中，反應溫度與配料比之間的交互影響為顯著影響因素。

2.1.3 響應面圖分析 通過響應面優(yōu)化實驗分析可以得到相應的響應面圖，響應面圖可以更加直觀的反映出各單因素對金銀花多糖乙?；〈鹊挠绊懡Y果以及各單因素之間交互影響的強弱關系。響應面實驗得到的響應面圖見圖4～圖6。

圖4 反應溫度與配料比對取代度的影響Fig.4 Effects of temperature and polysaccharidesto－acetic anhydride ratio on the DS

對比圖4～圖6可知:配料比對金銀花多糖乙酰化的取代度的影響極為顯著，圖中可看出其繪制的曲線最為陡峭;反應溫度對乙酰化的影響次之，而影響最小的則是反應時間，相較于反應溫度而言，其曲線較為平滑一些。通過響應面法預測得到的回歸模型分析［9］，可預測得到金銀花多糖乙?；淖顑?yōu)合成工藝條件是:反應溫度是72.3℃，配料比是2.15，反應時間是4.16h，預測的工藝條件下，得到的乙酰化多糖的取代度為0.457。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

圖5 反應溫度與反應時間對取代度的影響Fig.5 Effects of temperature and time on the DS

圖6 配料比與反應時間對取代度的影響Fig.6 Effects of polysaccharides－to－acetic anhydride ratio and time on the DS

2.1.4 驗證實驗 按照上述預測的結果，從實驗操作的可操作性考慮，微調上述工藝條件為:反應溫度是72℃，配料比是2.15，反應時間是4.2h，在微調后的乙?；揎椀墓に嚄l件下，做3次多糖乙?；叫袑嶒?，得到的乙?；疸y花多糖乙?；〈鹊钠骄禐?.452，實驗結果表明，通過回歸方程預測得到的工藝條件與實際操作工藝條件十分吻合。

2.2 乙?；疸y花多糖的抗氧化活性

2.2.1 羥自由基的清除實驗 本研究分別考察了金銀花多糖乙?；揎椙昂髮αu自由基的清除作用，實驗結果見圖7。

圖7 羥自由基的清除實驗Fig.7 The hydroxyl radical scavenging

由圖7可知，經過乙酰化修飾后的金銀花多糖清除羥自由基的最大清除率為76.3%，比乙?；岸嗵堑淖畲笄宄?0.2%提高了26.7%，清除羥自由基的能力有了明顯的提高。

2.2.2 超氧陰離子的清除實驗 本研究分別考察了金銀花多糖乙酰化修飾前后對超氧陰離子的清除作用，實驗結果見圖8。

圖8 氧陰離子的清除實驗Fig.8 The superoxide anion scavenging

由圖8可知，經過乙?；揎椇蟮慕疸y花多糖清除超氧陰離子的最大清除率為94.7%，比乙?；岸嗵堑淖畲笄宄?0.2%提高了18.29%，清除超氧陰離子的能力也有了明顯的提高。

上述抗氧化性實驗結果說明，乙?；揎椀慕疸y花多糖，其親水性發(fā)生了改變，這可能是使其抗氧化活性高于未修飾多糖的原因，關于此，進一步的研究尚在進行之中。

3 結論

本研究對金銀花多糖進行乙?；揎椀墓に嚶肪€進行研究，并通過響應面分析方法優(yōu)化了其最優(yōu)的修飾工藝條件是:反應溫度是72℃，配料比是2.15，反應時間是4.2h，在此條件下修飾制得的乙?；疸y花多糖的乙?；〈葹?.452，利用該方法對多糖進行乙?；揎?，具有反應可操作性強，試劑便宜易得，多糖的乙?；〈容^高的優(yōu)點，是一種較理想的多糖乙酰化修飾方法。通過金銀花多糖乙酰化衍生物超氧陰離子和羥自由基的清除實驗表明，經過乙?；揎椇蟮目寡趸芰^之乙酰化修飾前的多糖有了非常明顯的改善，其抗氧化能力進一步增強，本研究的成果為金銀花多糖在藥品、功能性食品等領域的進一步開發(fā)利用提供了一定的理論依據。

［1］畢躍峰，田野，裴姍姍，等.金銀花化學成分分析［J］.鄭州大學學報理學版，2007，39（2）:184－186.

［2］劉恩荔，李青山.金銀花的研究進展［J］.山西醫(yī)科大學學報，2006，37（3）:331－334.

［3］林雄平，陳曉清，蘇育才，等.金銀花和苦丁茶多糖提取物抗菌活性研究［J］.亞熱帶植物科學，2008，37（1）:51－53.

［4］殷洪梅，呂新勇，蕭偉.金銀花多糖的制備工藝優(yōu)化及免疫活性研究［J］.中國中藥雜志，2010，35（4）:453－455.

［5］李爾春.金銀花多糖的分離純化與生物活性研究［D］.西安:陜西師范大學，2009.

［6］劉光海.金銀花多糖的提取、精制及含量測定［J］.湖南中醫(yī)藥大學學報，2009，29（11）:33－34.

［7］鄧慶華.用正交實驗法優(yōu)化金銀花多糖提取工藝［D］.長春:東北師范大學，2008.

［8］殷洪梅，尚強，蕭偉.金銀花多糖脫蛋白方法的研究［J］.中草藥，2010（4）:584－586.

［9］趙鵬，李穩(wěn)宏，朱驟海，等.響應面法優(yōu)化金銀花多糖超聲提取工藝研究［J］.食品科學，2009，30（20）:151－154.

［10］張玉，馬力，陳文.醇析水提法提取金銀花多糖［J］.醫(yī)藥導報，2006，25（11）:1118－1120.

［11］梁進，張劍韻，崔瑩瑩，等.茶多糖的化學修飾及體外抗凝血作用研究［J］.茶葉科學，2008，28（3）:166－171.

［12］H M Qi，Q B Zhang，T T Zhao，et al.In vitroantioxidant activity of acetylated and benzoylated derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa（Chlorophyta）［J］.Bioorganic ＆Medicinal Chemistry Letters，2006，16:2441－2445.

［13］H M Qi，T T Zhao，Q B Zhang，et al.Antioxidant activity of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa Kjellm（Chlorophyta）［J］.Journal of Applied Phycology 2005，17:527－534.

［14］姚祥雨.香菇多糖及其衍生物對醫(yī)用高分子材料表面修飾研究［D］.武漢:武漢理工大學，2011.

［15］彭芳等.紫外分光光度法測定魔芋多糖中乙酰取代度［J］.藥物分析雜志，2010，30（5）:919－921.

［16］趙鵬.款冬花多糖提取純化工藝研究及結構鑒定［D］.西安:西北大學，2010.