烏賊墨多糖對環磷酰胺致小鼠卵巢損傷的保護作用

谷毅鵬，張云波，劉華忠，樂小炎，陶葉杏，肖 為，羅 萍，*

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088;2.廣東海洋大學農學院，廣東湛江 524088;3.廣東海洋大學生物化學中心，廣東湛江 524088）

烏賊墨來自海洋軟體動物烏賊的墨囊，在遇敵時噴出用以逃生，是一種具有多種生理功能的海洋活性物質［1］。烏賊墨多糖（Squid ink polysaccharides，SIP）是烏賊墨中最主要的活性成分之一，具有抗腫瘤［2］、抗氧化［3］、抗菌［4］、增強免疫［5－6］等生物學活性，近年來，本課題組發現并報道了SIP的化學防御功能［7－8］，能有效緩解環磷酰胺（Cyclophosphamide，CP）對模型動物生殖功能的毒性損傷［9－11］。CP是最常用的化療抗腫瘤藥物，也是治療自身免疫性疾病最強的烷化劑類藥物，在臨床上應用十分廣泛［12－14］。但是CP又可導致卵巢功能嚴重損傷，出現卵巢萎縮，間質纖維化，原始卵泡減少，使卵巢功能過早衰竭甚至不孕［15－16］。CP導致的卵巢損傷會對女性患者造成身體和心里上的嚴重影響，降低女性患者化療后生活質量和信心，因此尋找能夠降低CP的卵巢毒害，保護卵巢功能的藥物及方法，已顯得尤為重要。本實驗通過對雌性小鼠腹腔注射CP來構建卵巢損傷模型，并給予烏賊墨多糖灌胃，以此來進一步探討SIP對CP致小鼠卵巢損傷的保護作用及可能的機制，為其在臨床上的應用尋求一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗動物 清潔級雌性昆明小白鼠 購自廣東省醫學實驗動物中心，體重約18～20g，共40只，在生化中心實驗動物房適應性飼養1～2周。

1.1.2 主要試劑 烏賊墨多糖 本實驗室制備［11，17］;木瓜蛋白酶 購自北京鼎國生物技術有限公司;注射用環磷酰胺（CP） 購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH－Px）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx） 均購自南京建成生物工程研究所;其它所有試劑 均為分析純。

1.1.3 主要儀器 KDC－160HR型高速冷凍離心機;FDU－1100型真空冷凍干燥機;UV－2550型紫外可見分光光度計;N－1000型旋轉蒸發儀;JY92－Ⅱ型超聲波細胞粉碎機;BX51型多功能顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 將40只雌性昆明小鼠隨機分成4組，即對照組、模型組、烏賊墨多糖（SIP）組、治療組，每組10只。各組實驗動物分組及藥物處理如表1所示，SIP組和治療組動物每天灌胃SIP（80mg/kg），對照組和模型組每天磷酸鹽緩沖液（PBS）灌胃;同時，模型組和治療組動物需腹腔注射環磷酰胺（CP），劑量為50mg/kg，每周一次，連續5周，其余兩組按同樣方法腹腔注射等量生理鹽水（NS）。

表1 實驗動物分組及藥物處理Table 1 Experimental animal grouping and drug treatment

各組實驗動物在末次藥物處理24h后稱重，摘眼球取血，然后脫頸椎處死，迅速取出雙側卵巢，去除周圍脂肪及結締組織，稱重，并根據實驗需要對卵巢分裝保存。常規分離血清，－20℃保存備用。計算小鼠卵巢指數:卵巢指數（%）=每只小鼠卵巢重量/每只小鼠體重×100。

1.2.2 組織病理學檢測 將卵巢組織固定于10%甲醛溶液中，梯度乙醇脫水，浸蠟8h，石蠟包埋，5μm切片，HE染色，在光學顯微鏡下觀察卵巢組織結構變化，并統計原始卵泡、初級卵泡、成熟卵泡和卵泡總數。

1.2.3 血清生殖激素的測定 血清中卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）和睪酮（T）水平的檢測均嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 卵巢抗氧化指標測定 取一側卵巢制成5%組織勻漿，備用。卵巢組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）均采用試劑盒說明書方法測定。

1.2.5 數據處理 使用SAS公司開發的JMP7.0軟件對實驗數據進行處理和分析，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 小鼠體重及卵巢指數

由表2可以看出，與對照組比較，模型組小鼠卵巢指數明顯降低，差異有統計學意義（p＜0.01），模型組小鼠體重也有所降低，但差異并不顯著（p＞0.05），表明CP對小鼠的卵巢指數的抑制作用很明顯;同模型組相比，治療組小鼠經SIP灌胃后體重變化不大，卵巢指數雖稍有增加，但差異也不明顯（p＞0.05）。

表2 小鼠體重及卵巢指數Table 2 The body weight of mice and ovarian index

2.2 組織病理學觀察

圖1 小鼠卵巢組織病理學觀察Fig.1 Histopathological observation of mouse ovaries

表3 血清性激素水平Table 3 The levels of sex hormones in serum

表4 卵巢組織中抗氧化指標Table 4 The tissue antioxidant index of ovarian

在光鏡下對小鼠卵巢組織切片進行觀察，如圖1所示，對照組（圖1A）和SIP組（圖1C）卵巢可見大量原始卵泡，較多的初級、生長和成熟卵泡以及黃體，形態規則，間質少;模型組（圖1B）卵巢的卵泡數目銳減，其中生長卵泡和成熟卵泡數量下降明顯，有的甚至消失，間質有纖維化;治療組（圖1D）卵巢的結構同模型組相比已有比較明顯的改善，卵泡總數增加，可見大量初級卵泡，并保存了較多生長卵泡，而且間質纖維化程度有所減輕。通過對各級卵泡進行計數，如圖2所示，模型組原始卵泡數、初級卵泡數、成熟卵泡數以及卵泡總數均顯著低于對照組，差異具有統計學意義（p＜0.01）;而SIP組與對照組相比，上述卵泡數的差異均不顯著（p＞0.05）;但治療組同模型組比較，原始卵泡數、初級卵泡數、成熟卵泡數以及卵泡總數均有明顯增高，且差異極顯著（p＜0.01）。結果表明，環磷酰胺能夠顯著降低小鼠各級卵泡數，破壞卵巢結構，而SIP能夠明顯緩解CP對小鼠卵巢組織結構和卵泡生長過程的抑制作用，提高各級卵泡數目，增強卵巢的儲備能力。

圖2 小鼠雙側卵巢各級卵泡總數Fig.2 Total bilateral ovarian follicles in mice

2.3 血清性激素水平

各組血清中性激素水平如表3所示，與對照組相比，模型組小鼠注射CP后，血清中LH水平明顯升高，差異極顯著（p＜0.01），血清中FSH和T水平也均顯著升高（p＜0.05），但E2水平卻明顯下降（p＜0.05），證明CP能顯著降低正常雌性小鼠血清中E2水平，顯著升高血清中FSH和T水平，并且能極顯著的升高血清中FSH水平;SIP組血清中的上述指標與對照組相差不大，不具統計學意義（p＞0.05）。同模型組比較，治療組血清中E2水平升高非常顯著（p＜0.01），血清中LH水平下降極其顯著（p＜0.01），FSH水平也下降明顯（p＜0.05），但血清中T水平雖有所下降卻不具統計學意義（p＞0.05）;由此可知，SIP能夠極顯著的抑制CP對雌性小鼠血清中LH和E2水平的影響，也能抑制CP對FSH的影響，但對血清中T水平的改善并不明顯。

2.4 抗氧化指標

從表4可以看出，當注射CP后，模型組小鼠卵巢組織中SOD活力和GSH－Px活力均比對照組低，并且差異極顯著（p＜0.01）;而經SIP灌胃后，同模型組相比，治療組小鼠卵巢中SOD活力明顯恢復（p＜0.05），GSH－Px活力也顯著升高，差異有統計學意義（p＜0.01）;從表4還能看出，與對照組比較，模型組小鼠卵巢MDA含量顯著升高（p＜0.01），GSH含量明顯降低（p＜0.01），但經SIP灌胃后，治療組雌性小鼠與模型組相比，卵巢中MDA含量明顯降低（p＜0.01），GSH含量顯著升高（p＜0.01）。結果表明，SIP能顯著抑制CP對小鼠卵巢組織造成的氧化損傷，提高卵巢組織中SOD和GSH－Px活力，降低MDA含量，升高GSH含量，從而有效保護卵巢組織細胞，增強整體抗氧化能力。

3 結論

環磷酰胺（CP）作為應用最廣泛的化療藥物，常用于治療惡性腫瘤及自身免疫疾病，但毒副作用強，易造成卵巢永久性損傷，致使卵巢早衰和不孕。CP導致卵巢功能性損傷的機理目前尚不明確，但一般認為，有絲分裂越活躍的細胞對細胞毒性藥物的敏感性越強，而正是由于CP破壞了增殖活躍的卵泡顆粒細胞和通過激活ROS介導的細胞凋亡信號通路，上調了生長卵泡的凋亡比率，導致性激素分泌減少，反饋性引起下丘腦促性腺激素釋放激素（GnRH）、垂體促性腺激素（FSH、LH）的分泌增加，加快原始卵泡向生長卵泡的發育，從而使其再次受到CP的破壞，形成惡性循環，最終耗竭原始卵泡的儲備［18－20］。本研究證實CP會導致血清中性激素水平失衡，破壞卵巢組織結構，對卵巢內的不同階段的生長卵泡有嚴重的殺傷作用，使卵巢產生明顯的氧化損傷。

烏賊墨多糖（SIP）是從烏賊墨中提取出來的海洋生物活性物質，具有抗化療作用，而且是一類高效、無毒、廣譜類細胞保護劑。本研究結果顯示，SIP能拮抗CP對卵巢的毒害:首先，增加原始卵泡數、初級卵泡數、成熟卵泡數以及卵泡總數（p＜0.01），提高卵巢的儲備功能，并在一定程度上修復CP對卵巢組織結構的破壞;其次，調節血清中E2（p＜0.01）、FSH（p＜0.05）和LH（p＜0.01）恢復至正常水平，降低CP對血清中性激素的影響;最后，還能顯著的提高卵巢組織中SOD活力（p＜0.05）和GSH－Px活力（p＜0.01），降低 MDA含量（p＜0.01），升高 GSH含量（p＜0.01），抑制卵巢組織的氧化損傷。SIP對CP致小鼠卵巢損傷產生的保護作用，可能是通過提高卵巢組織的抗氧化能力，緩解了CP對卵泡顆粒細胞和卵泡膜細胞的毒性損傷，抑制生長卵泡的不正常凋亡，調控下丘腦－性腺軸對性激素的正常分泌，從而保護卵巢組織結構，增強卵巢的儲備能力。然而，目前關于CP拮抗劑在化療過程中對卵巢的保護作用已有大量研究，但其作用機制還存有較大爭議，因此對于SIP的這種保護作用以及機理還需要更多的科學實驗來證實。

［1］杜鐵平，周培根.烏賊墨研究概況［J］.食品研究與開發，2002，23（6）:16－18.

［2］Takaya Y，Uchisawa H，Matsue H，et al.An investigation of the antitumor peptidoglycan fraction from squid ink［J］.Biological and Pharmaceutical Bulletin，1994，17（6）:846－849.

［3］Luo P，Liu H.Antioxidant ability of squid ink polysaccharides as well as their protective effects on deoxyribonucleic acid DNA damageinvitro［J］.African JournalofPharmacy and Pharmacology，2013，7（21）:1382－1388.

［4］吳金龍，羅劍秋，劉華忠，等.烏賊墨多糖對冷藏魷魚的防腐保鮮作用研究［J］.食品科學，2010，31（10）:304－307.

［5］陸通，高春義，朱有名，等.烏賊墨升白作用的研究［J］.實用中西醫結合雜志，1995，8（3）:163－164.

［6］Liu H Z，Luo P，Chen S H，et al.Effects of squid ink on growth performance，antioxidantfunctions and immunity in growing broiler chickens［J］.Asian－Aust J Anim Sci，2011，24（12）:1752－1756.

［7］劉華忠，王光，吳金龍，等.烏賊墨多糖對環磷酰胺致小鼠部分臟器損傷的緩解效應［J］.中國現代應用藥學，2012，29（2）:89－93.

［8］王光，鐘杰平，劉華忠.烏賊墨多糖緩解環磷酰胺致大鼠骨髓功能抑制作用的研究［J］.食品工業科技，2012，33（17）:365－367.

［9］王光.烏賊墨多糖的化療保護作用研究［D］.湛江:廣東海洋大學，2010.

［10］樂小炎，許澤旋，師麗莎，等.烏賊墨多糖對環磷酰胺損傷小鼠生精功能的影響［J］.中國海洋藥物，2012，31（5）:23－26.

［11］樂小炎，原林，林少杰，等.烏賊墨多糖的制備及對睪丸化療性損傷的保護作用［J］.食品工業科技，2013，34（17）:342－344，348.

［12］Emadi A，Jones R J，Brodsky R A.Cyclophosphamide and cancer:golden anniversary［J］.Nature Reviews Clinical Oncology，2009，6（11）:638－647.

［13］Brodsky R A.High－dose cyclophosphamide for autoimmunity and alloimmunity［J］.Immunologic research，2010，47（1 － 3）:179－184.

［14］Sistigu A，Viaud S，Chaput N，et al.Immunomodulatory effects of cyclophosphamide and implementations for vaccine design［C］//Seminars in immunopathology.Springer－ Verlag，2011，33（4）:369－383.

［15］Molina J R，Barton D L，Loprinzi C L.Chemotherapyinduced ovarian failure:manifestations and management.［J］.Drug Safety，2005，28（5）:401－416.

［16］李超然，石紅.化療導致卵巢損害的保護措施研究進展［J］.大連醫科大學學報，2011，33（4）:402－405.

［17］師莉莎，劉華忠，吳金龍，等.酶法提取烏賊墨多糖工藝探討［J］.食品科技，2011，36（4）:138－141，147.

［18］Kishk E A F，Ali M H M.Effect of a gonadotropin－releasing hormone analogue on cyclophosphamide－induced ovarian toxicity in adult mice［J］.Archives of gynecology and obstetrics，2013，287（5）:1023－1029.

［19］王雪峰，何援利.慢病毒介導Bcl－2基因保護化療大鼠卵巢損傷的作用及機制［J］.廣東醫學，2013，34（2）:187－191.

［20］井甜甜，何援利.促性腺激素釋放激素激動劑對大鼠化療損傷卵巢功能的保護作用［J］.中國婦幼保健，2008，23（16）:2276－2279.