膀胱尿路上皮癌中MIF與VEGF的表達及其臨床意義

張 珺，吳 奎，肖 峻，陳遠哲，熊 宇

巨噬細胞移動抑制因子(microphage migration inhibitor factor，MIF)主要由活化T淋巴細胞分泌，早期發現與炎癥反應及免疫應答有關的細胞因子。近年來研究［1］顯示，MIF在腫瘤的發生發展過程中具有重要的作用，具體表現在促進細胞的增殖、分化、腫瘤血管的形成、腫瘤侵襲能力，甚至抑制腫瘤細胞的凋亡等。實體腫瘤血管的形成是其生長和遷徙的基礎，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是新生血管形成過程中最重要的刺激因子之一，它能夠通過誘導腫瘤血管的形成促進腫瘤的浸潤轉移。研究［2］顯示VEGF與膀胱移形細胞癌的侵襲能力有關，并可能作為判斷預后的指標。該研究主要探討MIF與VEGF在膀胱尿路上皮癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)組織中的表達及其臨床意義，并分析二者之間可能存在的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2011年2月～2012年6月在安徽醫科大學附屬省立醫院泌尿外科接受手術治療的BTCC患者75例，男45例，女30例，年齡16～81(58.30±22.61)歲。根據國際抗癌協會2009年第7版TNM病理臨床分期和2004年WHO病理分級標準進行組織學分級和分期，其中表淺性(Ta～T1期)50例，浸潤性(T2～T4期)25例。低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀瘤28例，低分級BTCC 26例，高分級BTCC 21例。伴有淋巴結轉移患者21例，無淋巴結轉移患者54例。患者均行手術治療，其中，經尿道膀胱腫瘤電切術47例，膀胱部分切除術24例，全膀胱術4例。另取12例正常膀胱黏膜組織作為對照組。標本取材后分兩部分，一部分立即放入RNA組織保護液中，4℃過夜，－80℃保存用于RT-qPCR;另一部分經過10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續切片后用于免疫組化染色。

1.2 主要試劑 抗人MIF單克隆抗體購自北京博奧森生物制藥公司;抗人VEGF、CD31單克隆抗體、S-P試劑盒(含二抗、DAB顯色劑)購自北京中杉金橋生物技術有限公司;熒光定量PCR檢測系統購自德國 Biometra;TRIzol Reagent、RNase抑制劑、反轉錄酶(含 buffer)、dNTP、SYBR Green qPCR mix購自大連寶生物工程公司;引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測mRNA表達 按照TRIzol說明書對所取組織進行RNA提取，并經紫外分光光度計測定A260/A280比值定量在1.8～2.0之間，以其為模板逆轉錄合成cDNA;MIF正向引物:5'-CCATGCCTATGTTCATCGTG-3'，反向引物為5'-GAACAGCGGTGCAGGTAAGTG-3';VEGF正向引物為:5'-ACGTCTGCGGATCTTGGACA-3'，反向引物為:5'-GGGCTGCTGCAATGATGAAG-3';所選內參為 β-actin，正向引物為:5'-CCAAGGCCAAC-CGCGAGAAGATGAC-3'，反向引物為:5'-AGGGTACATGGTGGTGGCGCCAGAC-3';RT-qPCR總反應體系為 25 μl，SYBR Green mix 12.5 μl，正反向引物各1 μl，ddH2O 8 μl，cDNA 2.5 μl，進行擴增并采用2－ΔCT計算mRNA相對表達量。反應條件:94℃ 3 min，1 個循環;94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，40個循環。

1.4 免疫組化染色 石蠟包埋組織4 μm連續切片，常規37℃烘烤30 min，后二甲苯、乙醇脫蠟、水化，3%過氧化氫溶液浸泡10 min，阻斷內源性過氧化物酶活性。VEGF采用高溫抗原修復20 min，MIF、CD31采用微波枸櫞酸鹽抗原修復，緩慢復溫至室溫水洗后PBS清洗3次，每次3 min，正常血清封閉15 min后加一抗(VEGF濃度為1∶400;MIF濃度為1∶400;CD31濃度為1∶500)，4℃過夜，PBS清洗3次，每次3 min。加生物素標記二抗，37℃孵育15 min，PBS洗滌3次，每次3 min;加DAB顯色劑，蘇木精復染，乙醇脫水，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照組。

1.5 結果判定 RT-qPCR完成后采用2－ΔCT計算mRNA相對表達量，并計算平均表達量。MIF和VEGF陽性型號均位于胞質內，細胞質、部分細胞膜、細胞核呈棕黃色為陽性細胞，每張切片在×400高倍視野下隨機選擇4個視野，計數陽性細胞數。“－”為不表達或者＜30%細胞表達，“+”陽性細胞數為30% ～50%，“”陽性細胞數為50% ～70%，“”陽性細胞數為＞70%。微血管密度(microvascular density，MVD)計數:先在低倍鏡(×100)下選擇出微血管最密集的區域，然后于高倍鏡(×400)下計數5個視野的微血管數目，取平均值作為該病例的MVD值。所有切片均經3位病理醫師在不清楚患者任何臨床資料的情況下獨立完成。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件分析，數據以±s表示，各指標與患者臨床病理資料的關系采用獨立樣本t檢驗和χ2檢驗進行比較分析，各指標間的關系采用Spearman相關分析進行檢測。

2 結果

2.1 MIF、VEGF mRNA的表達差異 實驗結果顯示MIF的PCR產物長度為368 bp，VEGF的PCR產物長度為380 bp，溶解溫度較均一，峰形也較銳利。分析mRNA表達情況，其中膀胱癌組織中MIF、VEGF mRNA的平均相對表達量與正常黏膜組織比較差異均有統計學意義(P=0.002，P=0.008);浸潤性癌組織中mRNA的表達量與表淺性癌組織比較差異有統計學意義(P=0.045，P=0.018)，見表1。

表1 MIF、VEGF mRNA的表達(±s)

表1 MIF、VEGF mRNA的表達(±s)

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2.2 MIF在BTCC組織中的表達 MIF陽性信號主要位于癌細胞胞質內(圖1)，75例BTCC組織中，53例呈陽性，MIF陽性率為70.6%。12例正常膀胱組織中MIF陽性1例，陽性率為8.3%，差異有統計學意義(P=0.000)。伴有淋巴結轉移的癌組織中MIF表達水平(20/21，95.5%)與無淋巴結轉移的癌組織(33/54，61.6%)比較，差異有統計學意義(P=0.004)。隨著BTCC臨床分期的增高，MIF陽性率呈上升趨勢，在淺表性和浸潤性癌組織中陽性率分別為66%、80%，差異有統計學意義(P=0.209)。隨著病理分級的增加，MIF陽性率分別為G1(53.6%)、G2(73.0%)、G3(90.4%)，且差異有統計學意義(P=0.018)。復發性癌組織中MIF陽性率高于初發性，差異有統計學意義(P=0.019)。MIF陽性表達率在性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤數量的患者之間，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

圖1 BTCC及正常膀胱黏膜組織中CD31、MIF和VEGF的表達 SP×400

表2 MIF、VEGF表達與膀胱癌臨床病理特征的關系

2.3 VEGF在BTCC組織中的表達 VEGF陽性信號主要位于癌細胞胞質中(圖1)，75例BTCC組織中，46例癌細胞呈陽性，MIF陽性率為61.3%。12例正常膀胱組織中均無表達，差異有統計學意義(P=0.000)。伴有淋巴結轉移的癌組織中VEGF表達水平(12/21，57.1%)與無淋巴結轉移的癌組織(34/54，63.0%)比較，差異無統計學意義(P=0.642)。隨著BTCC臨床分期的增高，VEGF陽性率呈上升趨勢，在淺表性和浸潤性癌組織中陽性率分別為50%、76%，差異有統計學意義(P=0.031)。隨著病理分級的增加，MIF陽性率分別為 G1(42.9%)、G2(65.4%)、G3(80.9%)，差異有統計學意義(P=0.022)。復發性癌組織中MIF陽性率明顯高于初發性，差異有統計學意義(P=0.002)。VEGF陽性表達率在性別、年齡、腫瘤大小及數量的患者之間，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

2.4 MIF與VEGF的相關性 75例 BTCC組織中，兩者均表達陽性的有38例，均無表達的有14例。采用Spearman秩相關分析后，兩者在BTCC組織中表達呈正相關(rs=0.330，P=0.004)，見表3。

2.5MIF、VEGF與MVD的關系 實驗結果顯示MIF、VEGF陽性例數MVD值高于陰性例數，差異有統計學意義(P=0.000，P=0.001)，見表4。

表3 MIF與VEGF在BTCC中的表達(n)

表4 MIF、VEGF與MVD的關系(±s)

表4 MIF、VEGF與MVD的關系(±s)

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3 討論

近年來，研究［1］表明MIF在腫瘤演變過程中發揮著重要作用，無論在腫瘤細胞增殖、分化、遷移還是腫瘤血管形成過程中都扮演著重要角色。Meyer-Siegler et al［3］發現膀胱癌細胞株 HT-1376 中存在MIF高表達現象;而通過對細胞加以外源性的MIF抗體或抑制劑后，其分泌受到抑制，同時該腫瘤細胞增殖明顯減弱，這表明MIF可能在促進BTCC癌細胞的增殖過程中起重要作用。Liu et al［4］研究亦發現，MIF高表達與腫瘤的遠處轉移有關，經MIF抑制劑處理后腫瘤細胞的轉移和侵襲能力明顯降低。此外，相關研究［5－6］顯示多種腫瘤中MIF的表達水平同P53蛋白、VEGF蛋白等的表達呈正相關，而這些蛋白均被認為在腫瘤的增殖、分化及血管形成等過程中扮演著重要角色。

本研究采用RT-qPCR、免疫組化方法分別檢測MIF在BTCC中的表達情況，結果顯示MIF在膀胱癌組織中的表達水平明顯高于正常黏膜組織。通過對免疫組化染色結果進一步分析顯示，MIF的表達水平在有淋巴結轉移癌組織中明顯高于無淋巴結轉移組織，高級別明顯高于低級別。這間接提示MIF蛋白在BTCC組織的生長、分化以及轉移等生物學行為過程可能發揮著重要作用，高濃度的MIF有可能促進上述一系列過程的發生。目前，RT-qPCR結果顯示MIF mRNA表達量在進展期癌組織中明顯高于早期癌組織，而免疫組化則顯示MIF蛋白表達水平與臨床分期無關。因此，在BTCC組織中MIF mRNA的表達與MIF蛋白的表達并非完全一致，這一現象在許多基因中普遍存在［7］。

實體腫瘤的生長有賴于腫瘤新生血管的形成，并且腫瘤新生血管的形成也是其轉移的病理生理基礎。血管形成是一個非常復雜的過程，在此過程中需要諸多因素的參與，如VEGF、血管生成素、堿性成纖維生長因子(bFGF)及環氧合酶-2等，其中VEGF所扮演的角色最為重要，它能夠與血管內皮特異性相結合，促進血管內皮細胞分裂增生、增強血管通透性，是作用最強的血管生成因子之一［8］。因此，其在腫瘤的生長、浸潤及轉移中起著重要作用。本研究RT-qPCR結果顯示，癌組織中VEGF mRNA的平均表達量高于正常組織，且浸潤性癌組織中mRNA平均表達量高于表淺性。免疫組化法結果顯示在不同分期、分級的腫瘤組織中，VEGF的表達水平存在差異，即分化越低、分期越晚的腫瘤組織中其含量越高。且對于復發性癌組織，VEGF表達明顯高于初發性，提示VEGF在BTCC復發時血管的形成和腫瘤發展同樣具有重要作用;但VEGF表達水平與有無淋巴結轉移無明顯相關性。筆者推測，這與腫瘤細胞淋巴結轉移機制相對復雜有關，單一因素并不能反映出其主要生物學特性，此外，本研究樣本量相對較少也可能是影響因素之一。

在MIF表達陽性組織中，VEGF和MVD表達均明顯增高，Spearman相關分析顯示MIF與二者呈正相關關系。提示MIF可能促進BTCC組織中VEGF的表達，從而達到間接促進腫瘤組織微血管形成的作用。Cheng et al［6］在宮頸癌的研究中發現，MIF與其受體CD74的高表達能夠增加VEGF的表達，并指出MIF在宮頸癌的腫瘤血管形成中扮演著重要的角色。Rubio et al［9］研究指出，腫瘤組織中 MVD可能成為淋巴結轉移以及患者預后的一個新的指標。本研究顯示MVD與淋巴結轉移相關，而另一方面，MIF與淋巴結轉移和微血管形成均成明顯的正相關性。因此，MVD是否能夠直接促進淋巴結轉移尚不明確，可能為一個伴隨關系，兩者之間相互作用關系仍需進一步研究。

綜上所述，MIF與VEGF的高表達且協同作用可能在BTCC的發生發展、浸潤轉移及復發方面具有重要作用，且MIF可能是影響BTCC腫瘤組織淋巴轉移、微血管形成和VEGF表達的重要因素，進一步研究其作用機制可能成為BTCC分子靶向治療中新的切入點。

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［3］Meyer-Siegler K L，Leifheit E C，Vera P L.Inhibition of macrophage migration inhibitory factor decreases proliferation and cytokine expression in bladder cancer cells［J］.BMC Cancer，2004，4:34.

［4］Liu H，Chen G，Zhang W，et al.Overexpression of macrophage migration inhibitory factor in adenoid cystic carcinoma:correlation with enhanced metastatic potential［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2013，139(2):287－95.

［5］龐國福，李解方，丁 平，等.P53和MIF在前列腺癌組織中的表達及臨床意義［J］.南華大學學報，2008，36(4):452－4.

［6］Cheng R J，Deng W G，Niu C B，et al.Expression of macrophage migration inhibitory factor and CD74 in cervical squamous cell carcinoma［J］.Int J Gynecol Cancer，2011，21(6):1004 －12.

［7］Ostlund G，Sonnhammer E L.Quality criteria for finding genes with high mRNA-protein expression correlation and coexpression correlation［J］.Gene，2012，497(2):228 －36.

［8］Kraizer Y，Mawasi N，Seagal J，et al.Vascular endothelial growth factor and angiopoietin in liver regeneration［J］.Biochem Biophvs Res Commun，2001，287(2):209 －15.

［9］Rubio L，Burgo J S，Morera C，et al.Morphometric study of tumor angiogenesis as a new prognostic factor in nasopharyngeal carcinoma patients［J］.Pathol Oncol Res，2000，6(3):210 －6.