雙水相純化淀粉糖化酶的影響因素研究

霍丹群，汪治宏，郭明遺，宋春霞，肖亞若，沈才洪，周 軍，曾 娜，侯長軍

（1.重慶大學生物工程學院，重慶 400044；2.國家固態釀造工程技術研究中心，瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000）

葡糖糖淀粉酶是我國最大、最重要的酶制劑產品之一[1]。產葡糖淀粉酶的菌株多有報道，如紅曲霉[2]、黑曲霉[3]、米根霉[4]等。從菌株的發酵液中分離酶液的方法主要有鹽析法，等電點沉淀法和有機溶劑沉淀法。但是這些方法在分離過程中容易發生蛋白質變性，導致蛋白分離提取的收率和效率相對較低[5]。

雙水相萃取技術克服了以上缺點[6]，雙水相的形成是一種聚合物與一種鹽在適當的濃度下混合于水就形成“互不親和”的雙水相體系，提取酶是根據蛋白質的鹽溶及靜電作用等因素分離出目標蛋白酶。PEG是一類具有良好親水性和生物兼容性的高分子聚合物，廣泛用于生物領域[7]。PEG的雙水相體系萃取技術也逐漸被人們重視和使用[6，8-10]。分離物質在雙水相體系中液-液相平衡模型理論時有報道。Khadijeh Khederlou等考察了頭孢氨芐在PEG4000和PEG10000與K2HPO4、檸檬酸鈉的雙水相中的分配額度[11]。Shahla Shahriari等研究了β-淀粉酶和淀粉轉葡糖苷酶在PEG/磷酸鹽中的分配性能，并對數據進行擬合，發現其分配形為與Flory-Huggins晶格模型相符[12]。Mona Mirsiaghi等研究了L-精氨酸鹽在PEG雙水相體系的分配性能，結果表明，鹽的濃度影響較大，溫度次之[13]。用PEG提取淀粉糖化酶的方法也相繼被探索[14]。

但是對于不同菌株的發酵酶液進行不同條件的探索的區分力度不夠。本實驗通過構建不同分子量的PEG與不同的鹽形成的雙水相系統，用于分離、提純四種不同菌體的淀粉糖化酶發酵液。不同的菌體發酵液中淀粉糖化酶和雜蛋白的含量均不同，所以有針對性的構建適用于不同體系的雙水相系統具有十分重要的理論意義和實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米根霉、根霉、酒精酵母和酯化酵母 由瀘州釀酒研究所提供；標準淀粉糖化酶（活力十萬個單位）、聚乙二醇（分子量分別是600、800、1000、2000） 分析純，阿拉丁；硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鈉 國產分析純；本次實驗所用水 為去離子水。

UV-1100型紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；AllegraX-22R型冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；HHS型水浴鍋 上海圣欣科學儀器有限公司；FD-2型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 培養基配方

斜面培養基（g/L）：馬鈴薯汁200g，葡萄糖20.0g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，瓊脂20.0g，pH6.00；種子培養基（g/L）：馬鈴薯汁200g，葡萄糖20.0g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，pH6.00，搖床培養，轉速200r/min；發酵培養基（g/L）：蛋白胨60.0g，橄欖油20.0g，麥芽糖10.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO42.0g，pH6.00，搖床培養，轉速200r/min。以上培養基均在121℃下滅菌21min。

1.3 實驗方法

1.3.1 純化工藝流程制作PEG1000/（NH4）2SO4相圖→培養四種不同的菌株→分別提取粗酶液→配制雙水相系統→將酶液與雙水相系統混合→漩渦振蕩→靜置分層→4℃冷凍離心，轉速1000r/min，時間2min→靜置分層→吸取上下層液體測定酶活值和蛋白質含量→計算分配系數→獲得目標酶液。

1.3.2 葡萄糖淀粉酶粗酶液的提取 低溫保存的菌株經過平板活化后，接入液體種子培養基培養。按5%的接種量，將種子培養基接入發酵培養基，發酵不同時間后得到葡萄糖淀粉酶的發酵液[15]。將獲得的粗酶液用8層紗布過濾，除去大部分的菌絲體。濾液于4℃冷凍離心，轉速2000r/min，離心5min，分離上清液4℃貯存備用。提取粗酶液后，為避免污染應盡快進行下一步實驗，同時在操作過程中應該避免一些抑制酶活的金屬如Fe2+、Cu2+的加入[16]。

1.3.3 葡萄糖淀粉酶活性的測定方法 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[17]稍作改進，具體操作如下：稱取可溶性淀粉20g緩慢加入100mL沸水中，攪拌至液體澄清透明。待溶液冷卻后，用容量瓶定容至100mL。向50mL的比色管中加入25mL的可溶性淀粉溶液，調節pH至4.6，40℃水浴5min。加入1mL活力單位分別為4、8、12、16、20、24U/mL的標準葡萄糖淀粉酶于比色管中。40℃水浴60min后加入200μL濃度為200g/L的NaOH溶液終止反應，并立即冷卻。取冷卻后的溶液1mL置于另一比色管中，加入2mL的DNS溶液，沸水浴2min后冷卻，然后用蒸餾水于定容至25mL，在540nm處測定吸光值，用蒸餾水代替酶液為空白樣。

葡萄糖淀粉酶的活力單位：1mL酶液在40℃，pH4.6條件下，1h水解可溶性淀粉產生1mg葡萄糖的酶量為1個酶活力單位（U），以 U/mL表示。

1.3.4 蛋白質含量的測量 采用考馬斯亮藍法測量蛋白質含量[18-20]，7支試管中，分別精確吸取0.1mg/mL的牛血清蛋白原液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40mL，用蒸餾水稀釋至2.0mL，然后分別加入5.00mL的考馬斯亮藍溶液，混合均勻，在595nm波長處比色測定，用2.0mL的蒸餾水代替蛋白溶液為空白樣。

1.3.5 PEG1000/（NH4）2SO4相圖的制作[21-23]稱取2.0g PEG1000于50mL的離心管，加入6.0g的去離子水溶解PEG，加入適量硫酸銨，漩渦振蕩，使溶液由澄清變為渾濁，出現明顯分層現象。記錄加入硫酸銨的量，加入1～2g的水，使溶液由渾濁變為澄清，記錄加入水的重量。再次加入0.3～0.5g的硫酸銨，使溶液由澄清變為渾濁，重復上訴步驟，記錄每次加入硫酸銨和水的質量，根據硫酸銨和PEG的質量分數繪制相圖。

1.3.6 雙水相萃取方法 用1.3.3和1.3.4的方法測定四種粗酶液的比酶活值和蛋白質含量。在15mL的離心管中配制雙水相體系，添加分子量為600、800、1000、2000的PEG為1.8g使PEG的濃度達到15%[24]。加入1.0～2.5g的NaH2PO4、（NH4）2SO4、MgSO4、pH均調節為4.6，準確吸取2mL四種發酵酶液置于15mL的離心管中。漩渦振蕩，靜置分層。4℃冷凍離心，轉速1000r/min，離心2min，離心液靜置一段時間直到分層明顯。用移液器分別吸取上下層液體各1mL稀釋兩到三倍后測定葡萄糖淀粉酶的酶活和蛋白質含量。計算分配系數K=下相比酶活/上相比酶活。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

用紫外分光光度計測540nm處吸光度，繪制酶活-吸光度標準曲線，以酶活為橫坐標，吸光度為縱坐標作標準曲線，得到線性方程為y=22.253x+1.6868（R2=0.9990），如圖1所示。

圖1 淀粉糖化酶標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose amylase

紫外分光光度計在595nm處測吸光度，繪制蛋白質-吸光度的標準曲線，以蛋白質為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線，得到線性方程y=0.3158x+0.004（R2=0.9968）。如圖2所示。

2.2 PEG1000/硫酸銨相圖

圖2 蛋白質標準曲線Fig.2 Standard curve of protein

以PEG的百分比為橫坐標，以硫酸銨的百分比為縱坐標，制出相圖如圖3所示。相圖的曲線能用冪函數較好的擬合y=45.224x-0.472，R2為0.9910。

圖3 硫酸銨與PEG1000的相圖Fig.3 The phase diagram of PEG and（NH4）2SO4

2.3 粗酶液的酶活及蛋白質含量

米根霉、根霉、酒精酵母、酯化酵母粗酶液的酶活和蛋白質測量結果如表1所示。從表1中可以得出，米根霉的蛋白質含量最高，酯化酵母的比酶活最高。說明酯化酵母的淀粉糖化酶粗酶液中所含的雜蛋白相對較少，而米根霉的中雜蛋白相比其他三組偏多。取α=0.05，做顯著性分析，得到酶活、蛋白質含量、比酶活的顯著性結果見表2～表4。其中p值均小于0.01，且F均比crit大，可以判斷四種發酵液的各參數存在顯著性差異。

表1 粗酶液的酶活和蛋白質測量結果Table 1 The enzyme activity and protein of crude enzyme

2.4 不同分子量的PEG和鹽對分離系數的影響

針對四種不同的葡萄糖淀粉酶發酵液做四種分子量的PEG和三種鹽的單因素實驗，得到它們對分離系數的影響見圖4。PEG為15%，鹽的添加量為剛好達到分層的克數，添加過多會破壞蛋白質表面的水化層，而且會擾亂雙水相系統，改變各相中成相物質的組成[25]不同鹽的添加量有差異，硫酸銨的添加量在1.3～1.8g之間，硫酸鎂2.0～2.6g，磷酸二氫鈉達到2.7g以上。硫酸銨對根霉的分配系數為0.083，效果較好。硫酸銨和硫酸鎂對酒精酵母和酯化酵母的分離效果接近。硫酸鎂對米根霉的分離效果明顯，分配系數較優都小于0.25，而對酒精酵母均大于0.3。PEG1000對四種酶液的分配系數都小于其他三組，說明PEG1000的分離效果最好。PEG1000對米根霉的分離系數最小達到0.082。

表2 酶活的顯著性分析Table 2 Significant analysis of enzyme activity

表3 蛋白質含量的顯著性分析Table 3 Significant analysis of protein

表4 比酶活的顯著性分析Table 4 Significant analysis of enzyme activity

2.5 不同分子量的PEG和鹽對酶活穩定性的影響

分別計算各組上相和下相的比酶活，得到PEG和鹽對比酶活的影響如圖5。圖5中可以明顯看出，米根霉和根霉的上下相的比酶活差距很大，而酒精酵母和酯化酵母則相對較小。說明米根霉和根霉的分離效果優于酒精酵母和酯化酵母。米根霉的比酶活最高達到147.16U/mg，根霉的為187.54U/mg，酒精酵母和酯化酵母分別是133.25、247.5U/mg。雖然米根霉和根霉的分離效果優于酵母，但是酯化酵母的粗酶液中的比酶活已經在150U/mg以上，所以即使在分離效果一般的情況下，酯化酵母的比酶活仍然高出其他的酶液。

2.6 蛋白質回收率對比

測量出酶液和純化之后的蛋白質含量，得到蛋白質回收率如圖6。從圖6可以看出，米根霉和根霉的蛋白質含量均在0.28mg/mL以上，而酒精酵母和酯化酵母的蛋白質含量平均在0.10mg/mL左右，米根霉、根霉和酒精酵母的蛋白質回收率在70%～87%之間，而酯化酵母則在88%～96%。說明米根霉，根霉，酒精酵母中雜蛋白去除量較多，酯化酵母較少。即雜蛋白含量較少的回收率較高。

2.7 純化倍數

圖4 不同分子量的PEG和鹽對分離系數的影響Fig.4 The influence of different molecular weight of PEG and salts on the separation factor

測量粗酶液的比酶活和純化之后的上相比酶活得到純化倍數如圖7所示。PEG600和磷酸二氫鈉對酶液的純化效果相對較差。米根霉的純化倍數最高為3.35，鹽為硫酸鎂，PEG分子量為1000。根霉在硫酸銨為添加鹽的條件下PEG2000的純化倍數大于PEG1000的純化倍數0.4，而PEG2000的分離系數比PEG1000的分離系數僅僅大0.03。為了使酶的純度提高，所以根霉的最佳PEG的分子量選定為2000。通過以上實驗，得到不同酶液的最優提取參數如表5所示。

3 結論

圖5 不同分子量的PEG和鹽對比酶活的影響Fig.5 The influence of different molecular weight of PEG and salts on the specific activities

通過對米根霉、根霉、酒精酵母和酯化酵母的葡萄糖淀粉酶發酵液的單因素實驗，得到米根霉的PEG分子量為1000，添加鹽為MgSO422.86%；根霉為PEG2000，鹽為（NH4）2SO414.37%；酒精酵母和酯化酵母的PEG均為1000，鹽為（NH4）2SO415.73%和（NH4）2SO413.33%。本方法對四種酶液的葡萄糖淀粉酶萃取條件進行優化，獲得的最優工藝參數，能有效的減少工藝操作的工作量，為進一步從有針對性的粗酶液中分離純化葡萄糖淀粉酶奠定基礎。

圖6 蛋白質回收率Fig.6 Recovery of protein

圖7 純化倍數Fig.7 Purification fold

表5 各酶最優工藝參數Table 5 The optimal process parameters

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