常壓室溫等離子體快速誘變選育丙酮酸高產菌株

司曉光，郭 剛，王小霞，鄭春陽，高 強，*

（1.工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津強微特生物科技有限公司，天津 300384）

丙酮酸是一種重要的有機酸，廣泛應用于化工、制藥、農用化學品和營養保健品等領域，近年來全球市場需求量不斷增長[1-2]。丙酮酸的工業生產方法主要有化學合成法、酶轉化法和微生物發酵法。化學合成法是利用化學方法在液相或氣相反應條件下中將酒石酸或乳酸氧化為丙酮酸脂[3]，進一步水解為丙酮酸，但該方法成本較高且污染嚴重。酶轉化法利用微生物細胞中的酶系將乳酸脫氫氧化成丙酮酸[4]，但該方法成本高，無法形成工業性生產。微生物發酵法生產丙酮酸具有效率高、污染小、原料葡萄糖成本低等優點，是一條極具發展前景的工業化生產丙酮酸的方法。但微生物產能低、可利用碳源種類有限等問題成為微生物發酵生產丙酮酸的瓶頸。為此篩選增殖速度快、丙酮酸產量高和可利用碳源廣泛的菌株成為了迫在眉睫的問題，國內外研究人員不斷從自然界中篩選優良菌株、優化培養基來提高產量，或者嘗試利用紫外線、化學誘變劑等方法誘變獲取高產菌株，雖然取得一些成效但還無法滿足市場的需求，因此需要尋找更有效的丙酮酸高產菌株選育方法顯得尤為重要[5]。

目前，我國在丙酮酸的發酵生產方面的研究處于國際先進水平。李寅等篩選到一株以葡萄糖為底物生產丙酮酸的光滑球擬酵母WSH-IP12，發酵55h，丙酮酸含量達到57.3g/L[6]；張澎湃通過誘變篩選得到一株高產丙酮酸的突變株TK418，經條件優化后丙酮酸產量較出發菌株提高了35.60%[7]；胡曉冰等研究了磷對丙酮酸發酵的影響[8]；趙博、王欽宏等對產丙酮酸的光滑球擬酵母菌3672進行高溫定向優化，丙酮酸含量達到28g/L，發酵時間有36h變為24h，發酵溫度由30℃提高到40℃[9]。

常壓室溫等離子（ARTP）誘變系統是近年來發展起來的微生物基因組快速誘變方法。ARTP誘變系統是利用等離子體中的活性粒子作用于微生物，使微生物細胞壁和細胞膜的結構及通透性改變，并引起基因損傷，進而使微生物基因序列及其代謝網絡顯著變化，最終導致微生物產生突變[10-11]。ARTP具有射流溫度低、產生的等離子體均勻、無需真空裝置、操作簡單、成本低、與生物大分子和細胞作用明顯等優點[12]，已成為快速突變微生物基因組的有效方法。研究表明，ARTP誘變育種技術可以快速地誘變細菌、微藻、真菌、酵母等微生物[13]，突變率高，并易獲得遺傳穩定性良好的突變株[14]。本研究利用新型常壓室溫等離子體（ARTP）誘變產丙酮酸的光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）Tp19，建立了應用CaCO3篩選平板透明圈與菌落直徑比與100孔板法快速簡便篩選突變株的方法，并通過搖瓶發酵確定了突變菌株的遺傳穩定性，以期獲得遺傳穩定性良好的丙酮酸高產突變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）Tp19（NA-+Bio-+TPP-+Pdx-） 天津科技大學生化工程研究室保藏；葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、（NH4）2SO4、MgSO4、煙酸、鹽酸硫胺素、生物素、鹽酸吡哆醇 分析純；丙酮酸 色譜純。

ARTP-II誘變系統 北京思清源生物科技有限公司；高效液相色譜儀Agilent 1200 美國安捷倫科技公司；紫外可見分光光度計TU-1810 北京普析通用儀器有限責任公司；Bioscreener全自動生長曲線分析儀FP-1100-C Oy Growth Curves Ab Ltd.；恒溫搖床HYG 上海欣蕊自動化設備有限公司；SBA-40E生物傳感儀 山東省科學院生物研究所。

1.2 培養基及培養方法

1.2.1 培養基

1.2.1.1 CaCO3篩選培養基 葡萄糖40g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，煙酸8mg，鹽酸硫銨素20μg，鹽酸吡哆醇0.5mg，生物素10μg，瓊脂20g，CaCO35g，蒸餾水定容至1L。

1.2.1.2 種子培養基 葡萄糖30g，蛋白胨10g，玉米漿5mL，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸餾水定容至1L。

1.2.1.3 發酵培養基[15]葡萄糖80g，硫酸銨8g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，煙酸8mg，鹽酸硫胺素20μg，生物素10μg，鹽酸吡哆醇0.5mg，CaCO330g（搖瓶12h添加），金屬離子母液5mL，蒸餾水定容至1L，pH5.6。

1.2.2 培養方法[15]

1.2.2.1 種子培養 從斜面培養基挑取1環活化好的菌種接種到含有50mL種子培養基的500mL三角瓶中，30℃、200r/min搖床振蕩培養20h。

1.2.2.2 發酵培養 以5%接種量接入含有50mL發酵培養基的500mL三角瓶中，30℃、200r/min搖床發酵培養36h。

1.2.2.3 100孔板種子/發酵培養 取40μL種子液加入含有360μL種子培養基/發酵培養基，置于Bioscreener全自動生長曲線分析儀中培養，培養條件見表1。

表1 Bioscreener操作條件Table 1 Operating conditions using Bioscreener

1.3 誘變與突變株選育

1.3.1 菌體前培養 取上述活化的種子液，以5%的接種量按上述培養方法培養8～9h，使細胞處于對數繁殖期。

1.3.2 菌懸液制備 取1mL上述培養液5000r/min室溫下離心5min，收集菌體，分別用1mL生理鹽水洗2次，然后將菌體重新懸浮于適量的無菌水中，制成細胞濃度為1×107cfu/mL的菌懸液。

1.3.3 ARTP誘變 取上述菌懸液10μL涂布于不銹鋼載片表面，晾干后移至ARTP-II誘變系統中誘變。誘變條件[16]見表2。

表2 ARTP誘變條件Table 2 Operating conditions using ARTP

將用ARTP處理后的載片置于含1mL生理鹽水的2mL離心管振蕩洗脫1min，涂布種子培養基平板（種子培養基加2%瓊脂）活菌計數。

1.3.4 突變株初篩 取誘變液稀釋涂布CaCO3篩選培養基平板，30℃培養36h，挑選R值（R值：透明圈直徑/菌落直徑）較大的單菌落接種到100孔板，30℃培養24h測定丙酮酸產量。

1.3.5 突變株復篩 將初篩產酸量較高的突變株搖瓶發酵36h，測定發酵液殘糖、丙酮酸和α-酮戊二酸的含量。

1.4 分析方法

1.4.1 菌體濃度測定 稀釋發酵液，測定660nm處吸光度值。

1.4.2 致死率計算 致死率（%）=100×（對照組活菌數-誘變組活菌數）/對照組活菌數

1.4.3 葡萄糖測定 用配有葡萄糖氧化酶膜的SBA-40E生物傳感儀檢測。

1.4.4 丙酮酸與α-酮戊二酸測定 高效液相色譜（HPLC）法，色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）；流動相0.1%H3PO4溶液；流速1.0mL/min；檢測波長210nm。

2 結果與討論

2.1 ARTP誘變致死曲線的測定

常壓室溫等離子體產生的活性粒子能夠破壞細胞結構，也能夠穿過細胞壁到達細胞內打斷基因、蛋白質分子等，從而導致大部分微生物死亡[17]。但少數經過ARTP照射過的微生物會通過本身的自動修復系統修復存活，并在這一過程中產生基因突變，因此選擇合適的ARTP誘變條件能夠實現微生物的快速誘變育種。

出發菌株菌懸液經不同的常壓室溫等離子束照射時間處理后，生理鹽水洗脫并稀釋涂布，進行平板計數。不經過照射處理的對照組菌懸液以同樣的方法進行平板計數，計算得到每個照射時間下的致死率（圖1）。

由圖1可知，常壓室溫等離子體與光滑球擬酵母Tp19菌株的致死率之間存在著明顯的劑量效應關系。ARTP處理80s時致死率達到90%以上；處理160s時致死率達到100%。由現代育種理論可知，當微生物菌種的致死率在90%～95%范圍時，正突變率最高，因此選擇80s為ARTP最佳誘變處理時間，此時致死率為91.7%。

圖1 不同ARTP照射時間下的致死率曲線Fig.1 Influence of exposure time on the fatality rate

2.2 突變株初篩及復篩

2.2.1 突變株初篩 誘變80s的處理液稀釋后涂布于CaCO3篩選平板，挑選出22株R值較大的單菌落，接種于100孔板并置于Bioscreener全自動生長曲線分析儀中培養20h，取40μL培養液接種于含有360μL發酵液的100孔板中，三組平行發酵測定24h丙酮酸和α-酮戊二酸含量，結果如圖2所示。

從圖2可以看出，CaCO3平板初篩得到突變株的丙酮酸產量與出發菌株TP19相比，只有8株菌增加，而其余14株菌降低。這一方面表明了CaCO3平板只能作為對產丙酮酸菌株的初篩，并不能作為精確衡量菌株產丙酮酸能力大小的依據；另一方面也說明對丙酮酸產量進行定量測定，即對突變株復篩是必要的。

圖2 突變株和出發菌株100孔板24h發酵時丙酮酸和α-酮戊二酸產量Fig.2 The pyruvate and α-ketoglutaric acid production of the mutants and the original strain in 100-well plate at 24h cultivation

2.2.2 突變株復篩 經過以上高通量篩選獲得8株突變株進行復篩，結果如圖3。從圖中可以看出有5個突變株（A109，A214，A302，A311，A605）的丙酮酸產量高于出發菌株Tp19，同時突變株的α-酮戊二酸產量低于出發菌株。這說明丙酮酸產量的提高是由于丙酮酸進入三羧酸循環的代謝流降低。作為糖酵解途徑的最終產物，丙酮酸又是三羧酸循環的代謝起點，處于代謝途徑中的關鍵代謝支點。因此，在保證細胞正常代謝的前提下盡可能減少丙酮酸的降解和轉化也是提高丙酮酸產量的有效方法。與此同時，在丙酮酸分離提取階段應盡可能降低非目標產物的含量以提高丙酮酸提取效率，因此較低的α-酮戊二酸可以降低提取成本，提高經濟效益[18]。

圖3 突變株和出發菌株搖瓶發酵36h的丙酮酸和α-酮戊二酸產量Fig.3 The pyruvate and α-ketoglutaric acid production of the mutants and the original strain at 36h shaking flask cultivation

2.3 突變株遺傳穩定性

誘變選育的突變體在傳代中可能會出現表型延遲現象，這樣就會導致篩選的高產菌株經過傳代后很快出現生產性狀“衰退”即丙酮酸產量下降。因此，對篩選到得3株高產突變株A214，A302與A311連續轉接7代進行遺傳穩定性傳代驗證，結果見圖4。

圖4 突變株的遺傳穩定性檢測Fig.4 Genetic stability of mutant strains

工業生產中的優良的菌株不僅要有較高的目的產物生成率和原料利用率，而且還應滿足生產性能穩定的要求，即相同的生產條件下菌株性能保持不變。由圖4可以看出，突變株A214產丙酮酸的遺傳性能穩定，發酵36h的丙酮酸產量保持在（37.43±0.16）g/L，比出發菌株（32.92±0.34）g/L提高了13.69%。表明該突變株產丙酮酸性能穩定，既可以滿足工業生產的要求，也可以作為后續實驗的出發菌株。突變株A302雖然遺傳性能穩定，但是丙酮酸的產量較A214低，而A311的丙酮酸產量起伏較大，不適合工業化應用。

3 結論

本研究表明，ARTP誘變育種方法能夠有效的誘變光滑球擬酵母（T.glabrata）Tp19菌株，而100孔平板培養可快速篩選產丙酮酸的突變株。通過搖瓶復篩和遺傳穩定性檢測，篩選出了一株丙酮酸的突變株A214，該突變株發酵36h的丙酮酸產量達到37.43g/L，比出發菌株提高了13.69%。說明ARTP誘變系統可以引起光滑球擬酵母Tp19的基因突變，突變株A214丙酮酸產量提高的原因尚不清楚，有待進一步研究。本文的實驗結果是在搖瓶條件下得到的，由于搖瓶培養過程中營養、溶氧和pH等條件不能調控，接下來需要通過發酵罐放大培養對突變菌株生產丙酮酸的過程和發酵特性進行分析，并進一步優化其發酵條件，為中試和大規模生產提供基礎。

[1]楊悅.工業發酵法生產丙酮酸[J].發酵科技通訊，2009，38（4）：20-22.

[2]Biwer A P，Zuber P T，Zelic B，et al.Modeling and analysis of a new process for pyruvate production[J].Ind Eng Chem Res，2005，44（9）：3124-3133.

[3]劉彩霞，杜海燕，孫家躍.丙酮酸及系列產品的檢測與應用[J].生命科學儀器，2006，6（4）：9-12.

[4]谷勁松，曲音波.丙酮酸的酶法轉化及乳酸氧化酶的研究進展[J].微生物通報，2003，30（1）：86-90.

[5]Li Y，Chen J，Lun S Y.Biotechnological production of pyruvic acid[J].Appl Microbiol Biotechnol，2001，57（4）：451-459.

[6]李寅，陳堅，梁大芳，等.營養條件對光滑球擬酵母發酵生產丙酮酸的影響[J].生物工程學報，2000，16（2）：225-228.

[7]張澎湃.丙酮酸高產菌株的選育及其發酵條件研究[D].河南：河南大學，2007.

[8]胡曉冰，林標聲.磷對丙酮酸發酵生產影響作用研究[J].河南師范大學學報，2011，39（1）：134-136.

[9]趙博，王欽宏，蔡靜平.光滑球擬酵母適應進化改善丙酮酸生產[J].中國釀造，2012，31（4）：125-129.

[10]Park J，Henins I，Herrmann H W，et al.An atmospheric pressure plasma source[J].Appl Phys Lett，2000，76（3）：288-290.

[11]Wang H B，Sun W T，Li H P，et al.Discharge characteristics of atmospheric pressure radio-frequency glow discharges with argon/nitrogen[J].Appl Phys Lett，2006，89（16）：161504.

[12]Li H P，Li G，Sun W T.Radio-frequency，atmosphericpressure glow discharges：producing methods，characteristics and applications in bio-medical fields[M].COMPLEX SYSTEMS：5th International Workshop on Complex Systems，AIP Conference Proceedings，2008，982：584-591.

[13]Wang L Y，Huang Z L，Li G，et al.Novel mutation breeding method forStreptomyces avermitilisusing an atmospheric pressure glow discharge plasma[J].J Appl Microbiol，2010，108（3）：851-858.

[14]Li G，Li H P，Wang L Y，et al.Genetic effects of radiofrequency，atmospheric pressure glow discharges with helium[J].Appl Phys Lett，2008，92（72）：221504.

[15]張健，高年發.利用響應面法優化丙酮酸發酵培養基[J].食品與發酵工業，2006，32（8）：52-55.

[16]Enache I，Naude N，Cambronne J P，et al.Electrical model of the atmospheric pressure glow discharge（APGD）in helium[J].Eur Phys J Appl Phys，2006，33（1）：15-21.

[17]Morfill G E，Kong M G，Zimmermann J L.Focus on plasma medicine[J].New J Phys，2009，11（11）：115011.

[18]趙南，劉義雄，闞好新，等.發酵法生產丙酮酸鈉提取工藝的研究[J].江西農業學報，2010，22（3）：161-162.