粟米米糠水溶性蛋白的提取工藝優(yōu)化

李新華，馬 博，錢丹丹，白宏琦

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粟米米糠 北票永豐雜糧食品有限公司；氫氧化鈉、氯化氫、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸 均為分析純，頂國(guó)化學(xué)試劑有限公司。

XA-1型固體樣品粉碎機(jī) 河南省鞏義市光壓儀器廠；pH-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；SHZIIIB型循環(huán)水真空泵 上海華琦科學(xué)儀器有限公司；TDL-5000B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；JAC-300N型數(shù)控超聲波清洗器 山東濟(jì)寧奧波超聲電氣有限公司；DZF6050型真空干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)提取率的測(cè)定 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：半微量凱氏定氮法。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取工藝流程 5g粟米米糠→粉碎機(jī)→過(guò)篩（60目）→水料比（10∶1）→5%NaOH調(diào)pH10→恒溫（45℃）水浴超聲波振蕩1.5h→5000r/min離心10min→取上清液抽濾→5%HCl調(diào)pH3.5→4000r/min離心15min→真空干燥。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 參照谷糠、大米米糠蛋白提取工藝，再結(jié)合粟米米糠蛋白提取的實(shí)際操作，選取影響蛋白質(zhì)提取率的幾個(gè)關(guān)鍵因素設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)[5]。

1.2.3.1 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 在pH10，45℃，水料比10∶1的條件下，考察不同提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5h）對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.3.2 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 在提取時(shí)間1.5h，45℃，水料比10∶1的條件下，考察不同提取pH（8、9、10、11、12）對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.3.3 水料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 在提取時(shí)間1.5h，45℃，pH10的條件下，考察不同水料比（6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1）對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.3.4 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 在提取時(shí)間1.5h，水料比10∶1，pH10的條件下，考察不同提取溫度（25、35、45、55、65℃）對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。

Relationship between the precipitation during the Jiangnan rainy seasons(JRS) and the preceding heat content

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，由于提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響范圍很小所以舍去，僅選取提取溫度（X1），pH（X2），水料比（X3）為自變量，以粟米米糠蛋白提取率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)[6]，實(shí)驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，再將所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，建立回歸模型，響應(yīng)面分析，優(yōu)化提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

圖1 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of corn bran protein using alkali extraction metho

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖1所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)提取率逐漸遞增，蛋白質(zhì)提取率變化范圍從74.2%～80.1%不大。在1.5h以后，蛋白質(zhì)提取率遞增速度減緩逐漸趨于平穩(wěn)。反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而會(huì)增加提取成本，降低勞動(dòng)效率，而且還會(huì)影響提取蛋白質(zhì)的品質(zhì)，所以最佳提取時(shí)間確定為1.5h。

2.1.2 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖2所示，在pH8～10，隨著pH的升高，蛋白質(zhì)提取率呈遞增趨勢(shì)；在pH10時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大；在pH10以后，隨著堿濃度繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)提取率呈遞減趨勢(shì)；由于強(qiáng)堿條件下粟米米糠蛋白中會(huì)發(fā)生一些不良反應(yīng)，如蛋白質(zhì)水解和變性，美拉德反應(yīng)加速，產(chǎn)生黑褐色物質(zhì)，提取物中非蛋白質(zhì)含量增加，純度降低[7]，從而使蛋白質(zhì)提取率下降，所以最佳的提取pH確定為10。

圖2 pH對(duì)粟米米糠蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction pH on extraction rate of corn bran protein using alkali extraction method

2.1.3 水料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖3所示，隨著水料比的不斷增大，蛋白質(zhì)提取率整體呈上升趨勢(shì)。在水料比6∶1～10∶1時(shí)，蛋白質(zhì)提取率遞增明顯。由于粟米米糠中含有一定量的膳食纖維和淀粉，具有較強(qiáng)的吸水膨脹能力，水料比過(guò)低時(shí)，物料會(huì)變得粘稠，流動(dòng)性差，難于攪拌，升高水料比可以提高蛋白質(zhì)提取率[8]；在水料比10∶1以后，蛋白質(zhì)提取率遞增緩慢逐漸趨于平穩(wěn)，這時(shí)水和堿的用量也會(huì)隨水料比的增大而增加，這樣會(huì)增加提取成本，所以最佳的提取水料比確定為10∶1。

圖3 水料比對(duì)粟米米糠蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-material ratio on extraction rate of corn bran protein using alkali extraction method

2.1.4 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖4所示，在溫度25～45℃時(shí)，隨溫度的升高，蛋白質(zhì)提取率呈遞增趨勢(shì)；在45℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大；在溫度45℃以后，隨著溫度持續(xù)升高，蛋白質(zhì)提取率明顯下降。這是因?yàn)楫?dāng)溫度較低時(shí)，水分子與蛋白質(zhì)分子間相互作用較小，溫度適當(dāng)增加，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生改變，分子立體結(jié)構(gòu)伸展，有利于蛋白分子與水分子的運(yùn)動(dòng)及相互作用，此時(shí)溫度起到增溶的作用[9-10]。溫度繼續(xù)升高，使蛋白質(zhì)空間構(gòu)相某些弱鍵斷裂，破壞了肽鍵的特定結(jié)構(gòu)，使得原來(lái)在分子內(nèi)部的一些非極性基團(tuán)暴露在分子表面，因而降低了蛋白質(zhì)的溶解度，促使蛋白質(zhì)分子之間的相互結(jié)合而凝結(jié)沉淀[11]，所以最佳的提取溫度確定為45℃。

圖4 提取溫度對(duì)粟米米糠蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of corn bran protein using enzymatic hydrolysis method

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)分析，進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共17個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中12個(gè)析因?qū)嶒?yàn)，5個(gè)中心實(shí)驗(yàn)。中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)用來(lái)估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析[12]，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and experimental results for response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面模型的建立 采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出粟米米糠蛋白提取率（Y）的回歸方程如下：Y=78.50+0.54X1-0.56X2+3.37X3-0.025X1X2-0.050X1X3+0.35X2X3-1.79X12-3.49X22-3.51X32

回歸方程中各因素響應(yīng)值的顯著性由F值來(lái)判定，p值越小，顯著性越高。對(duì)回歸方程做顯著性檢驗(yàn)與方差分析[13]，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

從表3結(jié)果可知，模型p＜0.0001極顯著，同時(shí)模型失擬項(xiàng)p=0.0607不顯著，說(shuō)明模型成立且誤差小，模型的決定系數(shù)R2=0.9864，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9688，說(shuō)明該模型能解釋96.88%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的3.12%不能用此模型來(lái)解釋，綜上所述該模型擬合程度良好，可以用此模型分析堿法提取工藝參數(shù)[14]；回歸方程的一次項(xiàng)中各因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響為水料比（X3）極顯著、pH（X2）顯著、提取溫度（X1）不顯著，二次項(xiàng)對(duì)其影響均極顯著，交互項(xiàng)對(duì)其影響均不顯著，說(shuō)明響應(yīng)值的變化相當(dāng)復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系；各因素的F值可以反映出各因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響的重要性，F(xiàn)值越大，表明因素影響越大[15]，所以各因素對(duì)蛋白提取率影響的大小順序?yàn)椋核媳龋╔3）＞pH（X2）＞提取溫度（X1）。

2.2.3 響應(yīng)曲面 根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)曲面，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析提取溫度（X1），pH（X2），水料比（X3）對(duì)粟米米糠蛋白提取率的影響，如圖5～圖7所示，隨著每個(gè)因素的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小[16]。比較圖5～圖7可知，水料比（X3）對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響最為顯著；而提取pH（X2）、提取溫度（X1）次之；在交互項(xiàng)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響中，提取pH與水料比（X2X3）的交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響最大，提取溫度與水料比（X1X3）次之，提取溫度與提取pH（X1X2）最小。

圖5 Y=f（X1，X2）的響應(yīng)面Fig.5Responsive surfaces of Y=f（X1，X2）

圖6 Y=f（X1，X3）的響應(yīng)面Fig.6Responsive surfaces of Y=f（X1，X2）

圖7 Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面Fig.7Responsive surfaces of Y=f（X2，X3）

2.2.4 工藝優(yōu)化 為進(jìn)一步確定最佳提取條件，利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的堿法提取粟米米糠蛋白的最佳條件是：提取溫度46.44℃，pH9.94，水料比10.95∶1，提取時(shí)間1.5h，在此工藝條件下，粟米米糠蛋白提取率的預(yù)測(cè)值是79.36%。為了方便實(shí)際操作，將工藝參數(shù)調(diào)整為：提取溫度46℃，pH10，水料比11∶1，提取時(shí)間1.5h，將此條件參數(shù)代入回歸方程得到的新預(yù)測(cè)值為79.34%，在此條件下進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得粟米米糠蛋白提取率為79.15%，與預(yù)測(cè)值僅相差0.19個(gè)百分點(diǎn)，稍低于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)值，但接近于最優(yōu)提取條件的預(yù)測(cè)值，所以實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相符合[17]，說(shuō)明調(diào)整后的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

利用堿溶酸沉法對(duì)粟米米糠進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，提取率高，操作簡(jiǎn)單，成本較低，可以推廣至工廠化生產(chǎn)；Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立了堿法粟米米糠蛋白提取工藝參數(shù)的二次回歸模型，經(jīng)驗(yàn)證該模型誤差小，擬合程度好，合理可靠，能夠較好地預(yù)測(cè)粟米米糠蛋白的提取率。通過(guò)對(duì)方差、響應(yīng)曲面、二次回歸方程的分析得到，各因素對(duì)粟米米糠蛋白提取率影響程度為：水料比＞提取pH＞提取溫度；兩因素交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響程度為：提取pH與水料比＞提取溫度與水料比＞提取溫度與提取pH；提取最佳條件為：提取時(shí)間1.5h、提取pH10、提取溫度46℃、水料比11∶1，蛋白質(zhì)提取率實(shí)際測(cè)得79.15%，達(dá)到了優(yōu)化的目的。

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