葡萄籽原花青素對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)抗衰老的影響

王艷菊，馬建偉，王曦茁，周 方，張柏林，*，汪來(lái)發(fā)，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，國(guó)家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091）

原花青素（procyanidins，PC）是聚多酚類(lèi)化合物，廣泛存在于多種植物體中，被認(rèn)為具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗炎、抗突變、保護(hù)心血管系統(tǒng)等多重功效[1-2]。目前對(duì)葡萄籽原花青素的研究多集中在抗氧化作用和對(duì)心血管疾病預(yù)防等方面，而對(duì)抗衰老的影響，報(bào)道相對(duì)較少。衰老是老齡化社會(huì)持續(xù)關(guān)注的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題之一，據(jù)2012年2月22日國(guó)家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)65歲及以上老年人口比重已達(dá)到9.1%，老年人口達(dá)到12288萬(wàn)人，我國(guó)已經(jīng)進(jìn)入老齡化社會(huì)。預(yù)計(jì)到2040年，我國(guó)60歲以上老年人口將達(dá)到約4億人，占總?cè)丝?6%。衰老以及與衰老相關(guān)的疾病已成為日趨嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，因此闡明衰老的機(jī)制以及干預(yù)衰老進(jìn)程具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。如果能夠通過(guò)食物達(dá)到延緩衰老的目的，對(duì)延緩生物衰老具有重要意義。江巖[3]以黑腹果蠅為模式生物，研究了新疆藥桑葚花青素對(duì)黑腹果蠅衰老的影響。研究表明喂食112.5mg/kg新疆藥桑葚花青素可以顯著延長(zhǎng)黑腹果蠅的半數(shù)致死時(shí)間、平均壽命及平均最高壽命，且存在劑量-反應(yīng)關(guān)系。Liu等[4]發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花青素可以延緩視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的衰老。Chio等[5]用WI-38人類(lèi)二倍體纖維母細(xì)胞經(jīng)300μmoL/L H2O2處理后做早衰細(xì)胞模型，與對(duì)照組相比，添加花青素組細(xì)胞的生存能力顯著增加，并顯著延長(zhǎng)了不同時(shí)期細(xì)胞的壽命。Yokozawa等[6]用老鼠作為模型，喂食柿子原花青素后顯著增加了早衰老鼠SAMP8的壽命，并且沒(méi)有引起諸如跳躍、倒掛在籠子上等行為學(xué)上的改變。

國(guó)內(nèi)外研究中，用于衰老研究的生物模型主要以果蠅和小鼠為主，近年來(lái)秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）作為一種熱點(diǎn)模式生物，因其生命周期短、個(gè)體小、易于培養(yǎng)[7]，且在衰老進(jìn)程方面，線蟲(chóng)與脊椎動(dòng)物有保守一致的特點(diǎn)等[8]，成為衰老研究中的首選模型[9]。本文選取來(lái)自葡萄籽中的原花青素作為材料，以衰老研究的熱點(diǎn)生物秀麗隱桿線蟲(chóng)為模式生物，研究了不同濃度下原花青素對(duì)線蟲(chóng)壽命、運(yùn)動(dòng)能力、生殖能力、氧化應(yīng)激和熱應(yīng)激等方面的影響，旨在評(píng)價(jià)葡萄籽原花青素延緩秀麗隱桿線蟲(chóng)衰老的效果，初步探討其作用機(jī)制，為葡萄籽原花青素的深度利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli）OP50、野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)（C.elegans）N2中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)；葡萄籽原花青素 陜西浩洋生物技術(shù)有限公司，純度≥95%；百草枯 SIGMA-ALDRICH公司，純度≥98%；瓊脂粉 日本Japan公司；胰蛋白胨 英國(guó)OXOID公司；CaCl2分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O 分析純，西隴化工股份有限公司；膽固醇、無(wú)水乙醇、NaCl 分析純，北京化工廠。

HPG-400HX人工氣候箱 中國(guó)深圳市永業(yè)昌機(jī)電有限公司；SMZ645體視顯微鏡 日本Nikon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 線蟲(chóng)培養(yǎng) 采用Brenner[10]的方法，將雌雄同體線蟲(chóng)飼養(yǎng)與涂布大腸桿菌OP50（E.coliOP50）的線蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（Nematode Growth Medium，NGM）上，培養(yǎng)溫度20℃，觀察線蟲(chóng)生長(zhǎng)情況，定期將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)至新的涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基中。

NGM固體培養(yǎng)基配方（1L）：氯化鈉3g，瓊脂粉17g，胰蛋白胨2.5g，加入975mL蒸餾水，120℃滅菌15min，55℃水浴15min后無(wú)菌條件下加入1mol/L CaCl2、1mol/L MgSO4及5mg/mL溶解于無(wú)水乙醇中的膽固醇各1mL和25mL 1mmoL/L pH6.0磷酸鉀緩沖液，混勻后倒入培養(yǎng)皿。

線蟲(chóng)的同期化方法：參照Lakowski等[11]的方法，將處于產(chǎn)卵期的雌雄同體線蟲(chóng)置于含或者不含原花青素的NGM板中產(chǎn)卵1～2h，移走成蟲(chóng)，將平板置于20℃培養(yǎng)，卵孵化后，線蟲(chóng)的發(fā)育即處于同一時(shí)期。

1.2.2 線蟲(chóng)壽命測(cè)定 將葡萄籽原花青素用蒸餾水溶解，配制成19mg/mL的貯存液，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌，備用。實(shí)驗(yàn)設(shè)定對(duì)照組（原花青素終濃度為0μg/mL）、低劑量組（原花青素終濃度為100μg/mL）、中劑量組（原花青素終濃度為200μg/mL）和高劑量組（原花青素終濃度為300μg/mL）。將原花青素貯存液按照比例加入NGM培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為100、200、300μg/mL，觀察線蟲(chóng)對(duì)添加在NGM培養(yǎng)基中原花青素物質(zhì)的生長(zhǎng)發(fā)育反應(yīng)。

按照同期化方法處理線蟲(chóng)，記錄產(chǎn)卵當(dāng)天為壽命實(shí)驗(yàn)第0d，注意在產(chǎn)卵期每天將線蟲(chóng)挑至新的涂有E.coliOP50的NGM板上。每天在顯微鏡下觀察線蟲(chóng)，并記錄線蟲(chóng)生存、死亡以及剔除出實(shí)驗(yàn)的數(shù)目。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)機(jī)械刺激無(wú)任何反應(yīng)即視為死亡。剔除標(biāo)準(zhǔn)：由于爬至平皿壁或蓋上而干死；蟲(chóng)卵在體內(nèi)孵化而成袋樣蟲(chóng)導(dǎo)致死亡；鉆進(jìn)培養(yǎng)基中。

1.2.3 運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定 分為對(duì)照組和200μg/mL原花青素組。按照同期化方法處理線蟲(chóng)，從第4d起，每天隨機(jī)抽取50～60條線蟲(chóng)，記錄線蟲(chóng)1min內(nèi)走過(guò)的峰數(shù)。

1.2.4 生殖能力測(cè)定 分為對(duì)照組和200μg/mL原花青素組。將同期化處理后的L4期線蟲(chóng)挑取至NGM板中，每板挑取一只線蟲(chóng)，每組30個(gè)平板，此時(shí)記錄生殖實(shí)驗(yàn)第1d。20℃培養(yǎng)，每隔8～12h將線蟲(chóng)挑至新的NGM板上，直至生殖能力喪失。計(jì)數(shù)產(chǎn)卵量，并將所有產(chǎn)卵板置于20℃孵育2d后計(jì)數(shù)子代數(shù)目，并統(tǒng)計(jì)孵化率。

1.2.5 應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)定對(duì)照組（0μg/mL GSP）和原花青素組（200μg/mL GSP）。首先，將線蟲(chóng)進(jìn)行同期化處理后置于20℃培養(yǎng)，為防止孵化的卵影響結(jié)果，產(chǎn)卵期每天將線蟲(chóng)挑至新培養(yǎng)基。參照Saul等[12]方法，在成年期的第6d，將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)至35℃進(jìn)行培養(yǎng)，每小時(shí)計(jì)數(shù)線蟲(chóng)死亡、存活的數(shù)目，計(jì)算線蟲(chóng)在35℃時(shí)的熱應(yīng)激存活率。每組30條，重復(fù)3次。線蟲(chóng)死亡標(biāo)準(zhǔn)同壽命實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.2 氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 將百草枯用蒸餾水溶解，分別添加到NGM培養(yǎng)基和含有200μg/mL原花青素的NGM培養(yǎng)基中，使其終濃度為10mmol/L。然后將NGM培養(yǎng)基分組為：正常NGM培養(yǎng)基（0μg/mL GSP），含有200μg/mL原花青素的NGM培養(yǎng)基（200μg/mL GSP），含有10mmol/L百草枯的NGM培養(yǎng)基（10mmol/L Paraquat），含10mmol/L百草枯和200μg/mL原花青素的NGM培養(yǎng)基（10mmol/L Paraquat+200μg/mL GSP）。將線蟲(chóng)進(jìn)行同期化處理后置于20℃培養(yǎng)，在成年期的第6d，將在正常NGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的秀麗隱桿線蟲(chóng)分別挑至正常NGM培養(yǎng)基（0μg/mL GSP）和含10mmol/L百草枯的NGM培養(yǎng)基（10mmol/L Paraquat）中；將在飼喂200μg/mL原花青素的秀麗隱桿線蟲(chóng)分別挑至含200μg/mL原花青素的NGM培養(yǎng)基（200μg/mL GSP）以及含10mmol/L百草枯和200μg/mL原花青素的NGM培養(yǎng)基（10mmol/L Paraquat+200μg/mL GSP）中，每隔24h記錄線蟲(chóng)存活情況，統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)在氧化應(yīng)激條件下的存活率（%）。每組30條，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用ANOVA分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度原花青素對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響

不同濃度的葡萄籽原花青素對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響如圖1所示。從線蟲(chóng)的全程生存情況看，與對(duì)照組（0μg/mL）相比，無(wú)論是采用中劑量組（200μg/mL）及高劑量組（300μg/mL）的原花青素飼喂線蟲(chóng)，均能使線蟲(chóng)生存曲線右移，但是采用低劑量組原花青素（100μg/mL）效果則不明顯。

圖1 線蟲(chóng)生存曲線Fig.1 Survival curves of C.elegans

如表1所示，就對(duì)照組而言，線蟲(chóng)的平均壽命為（20.6±3.0）d，最大壽命為（26.3±1.2）d。對(duì)中劑量組而言，線蟲(chóng)的平均壽命為（25.9±4.2）d，延長(zhǎng)了25.7%（p＜0.001）；最大壽命為（32.6±1.9）d，延長(zhǎng)了24.0%（p＜0.01），與對(duì)照組相比，差異極顯著。對(duì)高劑量組而言，線蟲(chóng)的壽命較對(duì)照組顯著延長(zhǎng)，其中平均壽命為（24.7±4.9）d，最大壽命達(dá)到（32.5±1.3）d，但對(duì)線蟲(chóng)壽命的延長(zhǎng)效果不如中劑量組，所以選取200μg/mL作為最優(yōu)劑量組，繼續(xù)進(jìn)行研究。

表1 不同濃度原花青素對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命的影響Table 1 Effects of procyanidins on the lifespan of C.elegans

Tadahiro等[13]研究了蘋(píng)果原花青素對(duì)線蟲(chóng)衰老的影響，結(jié)果表明采用65、100μg/mL的蘋(píng)果原花青素飼喂線蟲(chóng)，線蟲(chóng)的壽命延長(zhǎng)效果分別為12.1%和12.0%，延長(zhǎng)壽命效果相似。Wilson等[14]在藍(lán)莓多酚研究中發(fā)現(xiàn)，與飼喂200μg/mL原花青素相比，取食67μg/mL原花青素能使秀麗隱桿線蟲(chóng)平均壽命的提高28%，壽命最大值提高14%。顯然，不同植物中所含原花青素因種類(lèi)與結(jié)構(gòu)不同，原花青素延緩衰老的適宜劑量或許也存在差異。

2.2 原花青素對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響

與對(duì)照組相比，飼喂原花青素的秀麗隱桿線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)速度增加，顯著差異從第6d開(kāi)始，平均每天每分鐘爬過(guò)的峰數(shù)顯著延長(zhǎng)13.2%（p＜0.05），表明飼喂原花青素增加了線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力，緩解了線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力隨年齡的增加而下降的情況（圖2）。

圖2 原花青素對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響Fig.2 Effects of procyanidins on the movement of C.elegans

2.3 原花青素對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)生殖能力的影響

飼喂原花青素后線蟲(chóng)的生殖峰期較對(duì)照組略有延遲（圖3）。在對(duì)照組中，線蟲(chóng)的生育高峰期發(fā)生在第1d至第3d，且第2d最多。對(duì)于原花青素組，則線蟲(chóng)的生育高峰期發(fā)生在第2d至第4d，且第3d最多。與對(duì)照組相比，盡管在原花青素組線蟲(chóng)總產(chǎn)卵量低，但是與對(duì)照組相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。將所有產(chǎn)卵板置于20℃孵育2d后計(jì)數(shù)子代數(shù)目，并統(tǒng)計(jì)孵化率（圖4）。在對(duì)照組，線蟲(chóng)的孵化率為95.6%±1.2%，在原花青素組則為94.4%±1.4%，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖3 原花青素對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響Fig.3 Effects of procyanidins on the reproduction of C.elegans

一般認(rèn)為，壽命的延長(zhǎng)或許與生殖能力存在固有的逆向關(guān)系[15]。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明飼喂原花青素并沒(méi)有影響秀麗隱桿線蟲(chóng)的生殖能力及卵的孵化率，也就是說(shuō)取食原花青素后，線蟲(chóng)壽命的延長(zhǎng)并不是以降低或喪失其生殖能力為代價(jià)的。自然界中，某些延長(zhǎng)壽命的天然物也存在類(lèi)似的現(xiàn)象[16]，如兒茶素、槲皮素、藍(lán)莓提取物等延長(zhǎng)了秀麗隱桿線蟲(chóng)的壽命，但并沒(méi)有影響產(chǎn)卵量[17-19]。

圖4 原花青素對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)孵化率的影響Fig.4 Effects of procyanidins on the hatchability of C.elegans

2.4 原花青素對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)壓力應(yīng)激能力的影響

熱應(yīng)激脅迫條件下，在成年的第6d，將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)至35℃培養(yǎng)，飼喂原花青素組線蟲(chóng)的生存曲線明顯右移。對(duì)照組（0μg/mL）的平均生存時(shí)間為（15.4±4.8）h，原花青素組的平均生存時(shí)間為（19.6±4.4）h，比對(duì)照組顯著延長(zhǎng)了27.3%（p＜0.01）。表明飼喂原花青素能顯著增強(qiáng)線蟲(chóng)的耐熱能力（圖5）。

圖5 熱應(yīng)激條件下線蟲(chóng)的生存曲線Fig.5 Survival curves of C.elegans in thermotolerance assays

線蟲(chóng)的生存曲線見(jiàn)圖6。在百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫條件下，在含有10mmol/L百草枯的NGM培養(yǎng)基（10mmol/L Paraquat）中培養(yǎng)的秀麗隱桿線蟲(chóng)的平均存活時(shí)間為（64.9±2.6）h，在含有10mmol/L百草枯和200μg/mL原花青素的NGM培養(yǎng)基（10mmol/L Paraquat+200μg/mL GSP）中培養(yǎng)的線蟲(chóng)的平均存活時(shí)間為（72.2±2.8）h，平均生存時(shí)間較含10mmol/L百草枯組延長(zhǎng)了11.2%（p＜0.05），由此可見(jiàn)，在氧化應(yīng)激脅迫條件下葡萄籽原花青素能夠很好的保護(hù)秀麗隱桿線蟲(chóng)，緩解極端氧化條件對(duì)線蟲(chóng)的損傷。

壽命的延長(zhǎng)與壓力應(yīng)激狀態(tài)下生存率的提高有很強(qiáng)的正相關(guān)性，線蟲(chóng)在脅迫條件下存活率越高，則延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲(chóng)壽命越好[20]。Wilson等[14]發(fā)現(xiàn)在35℃熱應(yīng)激16h的條件下，飼喂藍(lán)莓多酚，線蟲(chóng)的存活率較對(duì)照組增加了2.5倍，但對(duì)于百草枯與H2O2所造成的氧化應(yīng)激脅迫，飼喂藍(lán)莓多酚并沒(méi)有增加線蟲(chóng)的存活率。Pietsch等[21]發(fā)現(xiàn)，槲皮素不僅可以延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲(chóng)的壽命，而且增加了線蟲(chóng)在熱脅迫和氧化脅迫下的生存率。

圖6 氧化應(yīng)激條件下線蟲(chóng)的生存曲線Fig.6 Survival curves of C.elegans in oxidative stress assays

3 結(jié)論

飼喂葡萄籽原花青素可以顯著增加線蟲(chóng)的壽命，增強(qiáng)線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力，延緩線蟲(chóng)的衰老過(guò)程，且200μg/mL原花青素或許有更好的延緩線蟲(chóng)衰老的效果，這種防止線蟲(chóng)壽命衰老的效果可能是通過(guò)改善壓力應(yīng)激條件下的生存率來(lái)達(dá)到的。

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