Gasbench Ⅱ-IRMS測定新鮮橙汁水中氧同位素方法

徐勝，鐘其頂，王道兵

（1.農夫山泉股份有限公司，浙江杭州310007；2.中國食品發酵工業研究院，北京100027；3.全國食品發酵標準化中心，北京100027）

目前國家標準GB/T 21731-2008《橙汁及橙汁飲料》雖然明確規定了非復原橙汁和復原橙汁的定義，尚未建立非復原橙汁和復原橙汁的有效鑒別配套技術方法。國際上通常采用橙汁中水的氧（18O/16O，記作δ18O）同位素比值作為NFC橙汁真實性鑒別特征指標[1-6]。如歐洲果蔬汁協會（AIJN）采用橙汁中水的δ18O值作為NFC橙汁和FC橙汁鑒別指標，其中美國官方分析化學家協會（AOAC）和歐盟委員會（CEN）先后制訂了測定（濃縮）橙汁水中δ18O的檢測方法標準。國內牛麗影和鐘其頂等人初步探討了水中δ18O在國內NFC橙汁真實性識別中的應用，研究表明NFC橙汁水中δ18O明顯區別于復原橙汁[7-8]。

目前，AOAC和CEN等測定橙汁水中δ18O的標準方法主要采用離線二氧化碳-水平衡法[9]，但該分析方法不僅存在樣品量大，勞動強度大，對實驗人員的要求高等特點，且無法實現全自動進樣，分析效率低，難以滿足大規模連續測定。在線二氧化碳-水平衡系統在近年來得到快速發展，Debajyoti Paul和Grzegorz Skrzypek研究了不同因素對GasBench-IRMS測定二氧化碳中δ18O時穩定性與準確性的影響，并對實驗條件進行了優化[10]；孫青等人應用GasBench II-IRMS分析天然水樣中δ18O，穩定性與準確性均比較理想[11]；張琳等人對離線水平衡-雙路進樣法和GasBench IIIRMS進行了比較，結果表明兩種方法測定水中δ18O的精密度和準確度基本一致，均能得到較好的分析數據[12]。本文通過優化方法參數，建立GasBench-IRMS測定橙汁中（尤其是新鮮橙汁）水的δ18O方法，探討在大規模連續進樣測定橙汁中水的δ18O在線分析系統。

1 材料方法

1.1 儀器和主要試劑

GasBenchII前處理裝置配備：GCPAL自動進樣器，PoraPlotQ色譜柱（25m×0.32mm），恒溫樣品盤（溫度精度±0.1℃），硼硅酸鹽反應瓶（12mL），進樣針和吹氣針。

檢測器為Delta V advantage（美國Thermo Finnigan公司），儀器控制軟件為ISODATE 3.0。

高純He、CO2標準氣和0.3%CO2+He混合氣，銅絲，活性碳粉末，乙醇（色譜純）。

1.2 實驗樣品

新鮮橙子采自安遠養生堂臍橙種植基地，去皮后榨汁，用三層紗布過濾后待測。

1.3 實驗方法

設定恒溫樣品盤溫度27℃，He壓力為80 kPa。在樣品瓶中加入銅絲和活性炭，加入樣品后放入恒溫樣品盤。固定進樣針和吹氣針，設定自動進樣器程序，充0.3%的CO2+He混合氣10 min，帶走瓶中的空氣。設定樣品充氣與樣品分析之間的間隔，使氣體CO2與水中氧發生同位素交換[13]。用質譜儀測定平衡后的CO2同位素比值。

1.4 結果表示

采用相對測量法表示物品中18O/16O，結果以δ（千分差，‰）表示

式中：R樣品為樣品中18O與16O的比值；R標準為標準物質VSMOW中18O與16O比值，18O/16O=（2 005.20±0.43）×10-6。

1.5 數據校正

樣品測定過程中插入質控水樣和標準水樣，依據Stephen等[14]報道的VSMOW/SLAP校正法進行校正。

2 結果與討論

2.1 參考氣分析精度

連續流-穩定同位素比值質譜儀測定時，參考氣分析精度的好壞直接影響樣品的分析精度和準確度。對于水中氧同位素分析，控制二氧化碳參考氣同位素分析內精度至關重要。連續10次通入參考氣，測定標準偏差（σ）＜0.015‰（見表1）；改變參考氣進樣量（以信號強度表示），測定值的變化率為-0.035‰/V（見表2）。表1和表2數據表明儀器的內精度符合測定要求，而CO2的進樣量在1 V～10 V變化時，δ18O分析結果不受影響。

系統內精度數據見表1，信號強度對δ18O的影響見表2。

表1 IRMS系統內精度δ18O（‰）Table 1 Inter-precision for δ18O analysis

表2 δ18O（‰）與信號強度的關系Table 2 Influence of intensities on the determination of δ18O

2.2 進樣系統穩定性

樣品瓶內氣體由進樣針導入GasBench，CO2經色譜柱分離純化后由八通閥導入IRMS中，連續進樣10次，測定值的標準偏差1-σ＜0.08‰（見表3），滿足同位素測定要求。

GasBench II-IRMS測定δ18O的進樣穩定性數據見表3。

表3 進樣系統穩定性δ18O（‰）Table 3 Inlet system stability for δ18O analysis

2.3 影響因素分析

2.3.1 樣品瓶氣密性

文獻[10]報道超過24 h時瓶內CO2中δ18O呈現偏重趨勢，即反應瓶氣密性變化導致瓶內氣體滲漏繼而出現同位素分餾。本實驗表明52 h之內CO2中δ18O值恒定（見圖1），這說明本研究所選擇的反應瓶能夠保證至少52 h內不出現同位素分餾。

測定時間對δ18O的影響見圖1。

圖1 反應瓶氣密性驗證Fig.1 Gastight test of vial

2.3.2 樣品體積的影響

孫青的研究表明樣品水體積對δ18O的分析結果有明顯干擾，當樣品水量較大時，測量值受體積的影響較小，而樣品水量較小時，測量值受體積的影響較大[11]。本研究分別向樣品瓶中加入0.2、0.5、1 mL橙汁樣品，結果（見表4）表明不同體積的橙汁樣品對水中δ18O的分析結果沒有明顯干擾，即由于橙汁樣品水中氧的量遠遠超過平衡物質CO2物質的量，平衡體系中CO2的初始同位素比值對分析結果沒有影響。

樣品體積對δ18O的影響見表4。

表4 樣品體積對水中δ18O（‰）測定的影響Table 4 Influence of sample volume on δ18O determination

2.3.3 平衡時間的選擇

CO2/He混合氣與水發生氧同位素交換，分別在12、16、20、24、32、40、48、72 h 時測定，反應時間在12 h～24 h時測得的氧同位素值比較偏負，且呈現逐漸偏正的趨勢，這表明水與CO2還未完全達到同位素平衡；反應24 h～72 h時測得的結果比較接近（見圖2）。

圖2 反應時間對葡萄酒水中δ18O的影響Fig.2 Influence of equilibrium time on δ18O determination

2.3.4 乙醇及發酵對橙汁水中δ18O測定的影響

GasBench-IRMS的應用優勢在于可不間斷測定大量樣品，由于同位素交換反應和樣品測定間隔的緣故，樣品在反應瓶中等待最少24 h、最多48 h才能進行測定，在此過程中橙汁（尤其是鮮橙汁）存在發酵的可能，然而發酵產生的CO2會嚴重影響水中δ18O的測定[15]。為研究橙汁自然發酵對測定的影響，分別對橙汁樣品按表5進行處理。

果汁發酵產生的CO2對δ18O的影響見表5。

表5 發酵對水中δ18O測定的影響Table 5 Influence of fermentation on the determination of δ18O

結果表明A組（反應瓶內有橙汁和CO2-He混合氣）中CO2的信號強度明顯增加，但增加的程度不同，這可能是由于待測過程中的先后順序不同導致反應瓶內樣品的發酵程度有差異；B中加入了乙醇，CO2的含量相對穩定且信號強度僅有9.5 V；向C和D中加入相同質量的酵母，另向C中加入乙醇，由表5可知D中CO2的信號強度明顯大于50 V，超過了IRMS的測定線性范圍；相對D，C中CO2信號強度顯著降低，僅比B高一點，這說明乙醇抑制酵母發酵的作用顯著。

為驗證乙醇對δ18O測定的影響，配制體積分數為0、5%、10%、15%、20%的乙醇水溶液，測定其水中δ18O（見表6），結果乙醇濃度在0%～20%范圍內時不影響水中δ18O的測定穩定性及結果準確性，因此可選用乙醇作為橙汁水中δ18O測定過程中的發酵抑制劑。

乙醇濃度對水中δ18O測定的影響見表6。

表6 乙醇溶液中的水中δ18OTable 6 δ18O-value of water in ethanol-water solution

2.4 方法穩定性

采用IRMS與GasBench II聯用，利用CO2-H2O平衡在線連續分析新鮮橙汁中氧穩定同位素組成，方法為：恒溫樣品盤溫度為27℃，He壓力80 kPa，0.5 mL橙汁樣品中加入活性碳、銅絲和0.05 mL乙醇后與0.3%CO2+He混合氣與平衡24 h～48 h，用質譜儀測定同位素交換平衡后CO2中δ18O，用標準水樣校正測定結果。

2.4.1 精密度

對同一橙汁樣品重復測定5次（見表7），橙汁水中δ18O的1-σ＜0.1‰。

GasBench II-IRMS測定果汁水中δ18O的精密度。

表7 水中δ18O（‰）精密度試驗結果Table 7 The precision of δ18O-value analysis of water in juices

2.4.2 再現性

選擇同一橙汁樣品每隔一周測定一次（見表8），1-σ＜0.1‰。

GasBench II-IRMS測定果汁水中δ18O的再現性結果見表8。

表8 水中δ18O（‰）再現性試驗結果Table 8 Reproducibility of δ18O-value of water in juices

由此可知，本法測定新鮮橙汁水中δ18O的精密度與再現性指標均比較理想，符合樣品水中δ18O測定的要求。

3 結論

本研究建立了GasBench II-IRMS測定橙汁氧同位素組成的在線分析方法：應用GasBench II設備對樣品進行水-CO2平衡，通過加入乙醇可有效抑制待測過程中果汁發酵，最后用IRMS測定CO2中δ18O并計算得出樣品水中δ18O。該法測定精密度和穩定性良好，穩定性高，相對于其他方法操作簡便、分析快速，適合果汁行業和檢測系統的大規模樣品測定，為我國建立NFC果汁技術標準體系提供科學方法支撐。

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