四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪鍵合硅膠固相萃取串聯高效液相色譜法測定水果中7種植物生長調節劑

張子方 陳彥龍 張文芬 王 菲 杜慧芳 導師：張書勝

（鄭州大學化學系，河南 鄭州 450001）

四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪鍵合硅膠固相萃取串聯高效液相色譜法測定水果中7種植物生長調節劑

張子方 陳彥龍 張文芬 王 菲 杜慧芳 導師：張書勝

（鄭州大學化學系，河南 鄭州 450001）

本文建立了四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪鍵合硅膠（NCS）固相萃取串聯高效液相色譜法（SPE-HPLC）測定水果中噻苯隆、2-（1-萘基）乙酸（α-萘乙酸）、對氯苯氧乙酸（防落素）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3）、1-（2-氯-4-吡啶基）-3’-苯基脲（KT-30）七種植物生長調節劑殘留的新方法。實驗采用自制四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪（NCS）作為固相萃取吸附劑提取、凈化樣品溶液，采用優化的W atersXBridge C18色譜分離柱和甲醇：0．1%磷酸溶液（55：45，v/v）流動相，在檢測波長210 nm時，在0．3-200μg/m L濃度范圍內七種植物生長調節劑線性相關性較好（R 2＞0．999）。七種植物生長調節劑回收率在77．2%-98．1%之間，相對標準偏差（RSD）小于5%，檢出限在4-22 ng/m L之間。結果表明該方法具有操作簡便、快速、靈敏、準確、重復性好等優點，可以滿足植物生長調節劑殘留的快速篩查和定量分析，是一種較為理想的多種植物生長調節劑同時分離檢測的新方法。

四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪；固相萃取；高效液相色譜；植物生長調節劑

1 引言

植物生長調節劑對植物生長具有促進其根、發芽、發育、早熟、防止落花、落果、形成無子果實，或抑制其發芽、整枝脫葉等作用[1]，能顯著地提高種植效益，因此，被廣泛地應用于現代化的農業生產中。

然而與其他農藥一樣，植物生長調節劑也具有一定的毒性，如丁酰肼的水解產物二甲基聯氨就是一種潛在的致癌物[2]。長期食用有植物生長調節劑殘留的水果、蔬菜等，會對人體產生副作用，使人體分泌紊亂，影響代謝的平衡[3]。目前，植物生長調節劑的濫用、使用不當等導致的食品安全問題逐漸增多，由此引發的食品安全事故也頻繁發生[4.6]，植物生長調節劑在食品中的殘留也因此成為影響我國食品安全的主要因素之一。因此，建立食品中植物生長調節劑殘留量的快速有效地檢測方法，對保證食品安全，促進人類健康及社會經濟發展都具有重大的現實意義。

目前，對植物生長調節劑的檢測方法有很多種，其中包括氣相色譜，液相色譜，氣質聯用，液質聯用技術等[7-13]。但在這些檢測中，氣相色譜和氣質聯用在應用中往往需要衍生化處理，以降低待測物質的氣化溫度，相對復雜；毛細管電泳技術靈敏度高，檢測限低但重現性差，不利于定量分析檢測；液相色譜、液相色譜-質譜聯用是近年來發展應用最為廣泛地檢測方法，但液相色譜-質譜聯用技術儀器成本較高，不利于一般實驗室的普及，且基質效應影響嚴重，對前處理要求苛刻；然而液相色譜相對簡單，可操作性強，且成本低易于普及，僅需簡單的前處理過程，可以滿足分析需求。

植物生長調節劑的檢測多伴隨復雜基質的存在都需要經復雜的前處理過程，目前，前處理方法主要包括加速溶劑萃取（ASE），液液萃取（LLE）和固相萃取。其中ASE和LLE是較為傳統的處理方式，處理過程中容易造成靶標物的損失，且需要消耗大量的有毒害的有機溶劑和勞動力，因此，近年來新型的固相萃取技術成為目前常用的前處理手段。常用的萃取柱有C18柱、HLB柱等，成本較高且作用力模式單一，不利于多種植物生長調節劑的同時凈化與富集。因此，有必要發展一種新型的固相萃取材料，實現多種植物生長調節劑的同時富集檢測。

我們課題組前期的大量研究工作表明四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪固相萃取吸附劑（圖1，顆粒直徑為40-60um）具有多重作用力模式[14-17]，適用于復雜基質中痕量靶標物質的富集與凈化，本文采用這種自制的杯芳烴固相萃取小柱，旨在建立多種植物生長調節劑簡單、快速、廉價、環保的同時分離檢測新方法。

圖1 NCS結構式

2 實驗部分

2.1 儀器，材料和試劑

葡萄、西瓜、蘋果、桃子（均購置于當地超市），2-（1—萘基）乙酸（萘乙酸，含量按98%計）、對氯苯氧乙酸（防落素，含量按98%計）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D，含量按98%計）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA，含量按98%計）、赤霉素（GA3，含量按98%計）、1-（2-氯-4-吡啶基）-3’-苯基脲（KT-30，含量98%計）；超純水（電阻率≥18.2MΩ·cm）；甲醇、乙腈（色譜純，美國J&TBaker公司）；磷酸（天津市科密歐科技有限公司）。Agilent1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；CP2245電子分析天平（感量：0.0001 g，德國Sartorius公司）；Milli—Q超純水儀（美國Millipore公司）；Turbo Vap II氮吹濃縮儀（美國Zymark公司）；Sigma 3-15低溫高速離心機（德國Sigma離心機公司）；KQ一700DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2.2 方法

2.2.1 NCS固相萃取柱的制備。自制NCS固相萃取小柱：商品化的聚丙烯空柱管（規格為100mg/3cc，迪馬科技公司）先用水和甲醇清洗，柱管的出口端與真空泵連接并使柱管垂直，稱取100mg自制的NCS，在負壓作用下裝入柱管，柱管中填料的兩底端分別用聚丙烯篩板固定，適度振實，備用。

2.2.2 樣品處理與分析

稱取樣品2.0 g（精確到0.001 g）勻漿后置于50mL具螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入10mL甲醇溶液，漩渦振蕩1min，在4℃下靜置過夜后超聲提取10min，2000 r/min轉速離心10min，取上層清液于30℃旋干濃縮，用水定容至1mL，后上樣至依次經4 mL乙腈活化，4mL水平衡后的NCS（或C18）柱床，采用3mL/min的流速過固相萃取小柱。后用4mL水淋洗柱床，6mL乙腈洗脫，收集洗脫液至15mL具刻度的試管中，45℃氮吹濃縮至近干，用甲醇定容至1.0mL。溶液過0.22mm濾膜，濾液供HPLC分析。

2.3 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（250×4.6mmi.d.，5μm），流動相：甲醇：0.1%磷酸水溶液（55：45，v/v），流速：0.7mL/min，進樣量：20μL，VWD紫外檢測波長：210 nm。

2.4 標準溶液的配制

萘乙酸、2，4-D、噻苯隆、6-BA、GA3、防脫落素、KT-30標準品0.02 g溶于100ml容量瓶中，逐級稀釋成2倍、5倍、25倍、125倍、625倍并繪制標準曲線。

3 結果與討論

3.1 固相萃取條件優化

本實驗使用四氮雜杯［2］芳烴［2］三嗪鍵合硅膠吸附劑（NCS）對七種進行富集，并且對NCS用量、吸附容量、不同洗脫劑、洗脫劑的用量、上樣體積、樣品pH值、上樣流速等影響固相萃取效率的因素進行了優化，最終選定條件為：100mg/3cc的固相萃取小柱，6mL的乙腈為洗脫劑，上樣流速3mL/min，上樣pH不需調整，富集效果如圖2所示。

圖2 NCS與C18固相萃取效果對比

3.2 標準曲線與檢測限

將1.4中的一級內標儲備溶液逐級稀釋2倍、5倍、25倍、125倍、625倍并繪制標準曲線，將配制的標準工作溶液由低到高濃度進行HPLC，以各標準物質的峰面積（Y）對相應的濃度（X，ng/ mL）進行線性回歸分析，得到七種植物生長調節劑的工作曲線回歸方程和相關系數r。將各物質最低濃度的標準工作溶液重復進樣5次，計算標準偏差，以3倍標準偏差為方法的檢出限，10倍標準偏差為定量限，結果如表1所示，在0.3-200μg/mL的線性動態范圍內混合物組分的線性相關系數較好，表明該方法線性關系良好。

表1 七種植物生長調節劑的線性方程、檢出限和定量限

3.3 回收率和精密度實驗

取空白桃子，制備低、中、高3種濃度（0.1、1和10μg/mL）的加標樣品，按前述樣品前處理方法處理樣品。低、中、高3個濃度的質控樣品分別取6份做日內精密度分析，得回收率和日內相對標準偏差。結果（表2）表明，低、中、高3個水平樣品的回收率在77.2%～98.1%之間，精密度在0.95%～4.53%之間，說明本方法的重復性較好、準確度較高。

表2 桃子中植物生長激素的加標回收率

3.4 實際樣品測定，采用上述方法，我們對市售的火龍果和葡萄進行了檢測，結果如表3所示。從以下結果可以看出，該方法可以成功的應用于水果實際樣品農殘的檢測。

表3

4 結論

四氮雜杯[2]芳烴[2]三嗪鍵合硅膠作為一種新型雜杯芳烴固相萃取材料，其對水果中七種植物生長激素的萃取效果要優于商品化的C18固相萃取柱。所建立的NCS固相萃取／HPLC方法操作簡便、準確度高，適合于不同水果中多種植物生長調節劑的檢測。

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R114

A

1671-0037（2014）11-106-3

張子方（1982.12-），男，本科，工程師，在讀在職研究生，研究方向：分析化學（儀器分析）。