羥基酪醇對過度訓(xùn)練大鼠心肌線粒體動力學(xué)蛋白及自噬水平的影響

孫云彥+殷紅

摘要：目的： 研究檢測ET后心肌線粒體功能，觀察羥基酪醇HT對線粒體功的保護(hù)效應(yīng)，并通過關(guān)注動力學(xué)及自噬蛋白變化，探討HT保護(hù)機制。方法： 80只SD大鼠隨機分成4組，即：正常對照組（CON），正常加羥基酪醇組（CON+HT），過度訓(xùn)練組（ET）及訓(xùn)練加羥基酪醇組（ET+HT）。灌胃給藥，劑量為25 mg/kg/d，每周訓(xùn)練時間為周一至周六，共8周，氧耗法測定線粒體呼吸功能。Westerblot法檢測線粒體生物合成（PGC-1α），復(fù)合物（I，II，III，IV，V），動力學(xué)（融合：Mfn1/2，OPA1；裂解：Drp1）及自噬相關(guān)蛋白（Atg5，Beclin-1及Lc3-B）。結(jié)果： ET可顯著性降低線粒體呼吸控制率（RCR）及磷氧比值（P/O），下調(diào)PGC-1α及復(fù)合物I，IV，V表達(dá)，增加線粒體裂解（Drp1），降低融合 （Mfn2，Opa1）。相對地，HT可有效提高線粒體P/O及復(fù)合物I，V表達(dá)水平；促進(jìn)生物合成（Pgc-1α），提高融合（Mfn2，Opa1），降低裂解（Drp1）和自噬 （Atg5，Lc3-B）。結(jié)論：ET造成的心肌線粒體功能異常與動力學(xué)蛋白及自噬水平變化相關(guān)。HT對上述病理性變化的抑制作用可能是其發(fā)揮保護(hù)作用的重要機制。

關(guān)鍵詞：過度訓(xùn)練；心肌；生物合成；裂解；融合；自噬

中圖分類號：G804.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-2076（2014）03-0051-06

收稿日期：2014-01-09

基金項目：國家青年科學(xué)基金資助項目（81100174）。

作者簡介：孫云彥（1982-），女，河南鄧州人，在讀博士，講師，研究方向運動性疾病及康復(fù)。

作者單位：1.南陽理工學(xué)院體育教學(xué)部，河南 南陽473003；2.河南大學(xué)體育學(xué)院，河南 開封475000

山東體育學(xué)院學(xué)報第30卷第3期2014年6月 孫云彥，等羥基酪醇對過度訓(xùn)練大鼠心肌線粒體動力學(xué)蛋白及自噬水平的影響No.3 2014過度訓(xùn)練（excessive training，ET）是一種訓(xùn)練與恢復(fù)、運動與運動能力、應(yīng)激與應(yīng)激耐受性之間的失衡狀態(tài)，是指機體由于疲勞的連續(xù)積累而導(dǎo)致機體出現(xiàn)功能紊亂或病理狀態(tài)[1]。現(xiàn)已研究證實，過度訓(xùn)練可損傷機體循環(huán)系統(tǒng)，引起心肌能量代謝酶，抗氧化蛋白表達(dá)水平降低[2-3]及心肌細(xì)胞凋亡水平增加[4]。另有研究指出，過度訓(xùn)練還可直接造成心肌線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放[5]。上述病理性改變，均與線粒體損傷及功能異常直接相關(guān)。然而，有關(guān)過度訓(xùn)練與心肌線粒體功能異常關(guān)系的研究卻鮮有報道。

羥基酪醇（Hydroxytyrosol，HT）存在于橄欖葉提取物及橄欖油， 是一種多羥基酚類化合物。其分子式為C8H10O3，相對分子量為154.16。研究證實，羥基酪醇在心血管疾病[6-8]及衰老相關(guān)性退行性病變，如二型糖尿病[9]，代謝綜合征[10]等的治療中均有出色效果。推測，HT也能對過度訓(xùn)練造成的心肌損傷（線粒體功能紊亂）產(chǎn)生積極影響。另外，新近研究指出，線粒體動力學(xué)蛋白[11-12]和線粒體自噬[13]與其功能密切相關(guān)。眾多與線粒體功能紊亂相關(guān)疾病的形成和發(fā)生均與動力學(xué)蛋白及自噬水平的病理性改變密切相關(guān)[11-12，14-16]。因此，線粒體融合，裂解和自噬成為近年來生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)研究的新熱點。

基于此，本研究建立了過度訓(xùn)練模型，并用HT作為干預(yù)手段，通過關(guān)注心肌線粒動力學(xué)蛋白及自噬水平的變化，探討HT對心肌線粒體的保護(hù)作用及內(nèi)在機制。

1材料和方法

1.1實驗藥劑

HT是由帝斯曼營養(yǎng)產(chǎn)品有限公司（Basel， Switzerland）提供的含量為15%的橄欖提取物粉末（19%總多酚）。抗體過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1 （Pgc-1） α，線粒體融合蛋白（Mfn） 1，2，裂解蛋白（Drp） 1購自于Santa公司 （Santa Cruz， CA，USA）；抗體GAPDH，視神經(jīng)萎縮蛋白（Opa） 1，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（Lc3B），Beclin-1及 自噬蛋白（Atg） 5 購于Cell Signaling Technology （Danvers，MA，USA）。抗體線粒體復(fù)合物I，II，III，IV和 V來自于Sigma公司（Sigma，USA）。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔及羊抗小鼠IgG抗體（GAPDH）及二抗購自于碧云天 （Beyotime，北京）公司；甘氨酸，Tris-base （AMRESCO，USA）；NC膜，ECL發(fā)光試劑購自于密理博 （MILLIPORE，USA）。

1.2研究對象

雄性Sprague dawley （SD）大鼠80只（購于鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心），6～8周齡，體重185～215 g。以國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料分籠飼養(yǎng)，每籠20只，自由飲食。實驗大鼠飼養(yǎng)于溫度為22℃～25℃，相對濕度為40%～60%，光照充足的動物飼養(yǎng)房。在正式的力竭實驗開始之前，所有大鼠進(jìn)行低強度訓(xùn)練 （10 m/min， 20 min/d） 進(jìn)行篩選及分組。分選完成后，大鼠分4組。即：對照組（CON），安靜+HT組（HT），過度訓(xùn)練組（ET）和過度訓(xùn)練+HT組（ET+HT）。

1.3運動方案

過度訓(xùn)練模型主要參考劉無逸等方法[17]。BW-BTM703型動物跑臺（上海軟隆科技）進(jìn)行訓(xùn)練，坡度為5°，每周訓(xùn)練6 （周一至周六）天，休息1天。訓(xùn)練時間共計8周。各周訓(xùn)練方案具體如下：①：10 m/min，15 min；②：24 m/min，60 min；③：30 m/min，90 min；④：40 m/min，120 min；⑤～⑧：40 m/min，訓(xùn)練直至力竭。當(dāng)體重下降幅度大于一般訓(xùn)練時體重的1/30及跑速和時間減為原最大值的1/3～1/6時為過度訓(xùn)練狀態(tài)[18-19]。

1.4HT給藥方案

HT采用灌胃給藥，具體用量25 mg/kg體重[20]。每日1次， 每周6天（周一到周六），連續(xù)8周。對照組和過度訓(xùn)練組不給藥。

1.5透射電鏡檢測進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察

電鏡樣品制備及檢測主要參考朱健等方法[21]。在最后一次力竭訓(xùn)練結(jié)束即刻處死大鼠，采用在體灌注法對大鼠心臟進(jìn)行固定。簡要如下：麻醉動物置于試驗臺，暴露心臟，打開右心耳，用加肝素的生理鹽水刺入左心室進(jìn)行1min左右灌注。之后，用灌注液 （0.2 M磷酸緩沖液的配制100 ml 25%戊二醛4 ml，重蒸餾水加到200 ml）灌流心臟。待右心耳流出液為無色時，換固定液（NaH2PO4·H2O 2.6 g，Na2HPO4·12H2O29 g，重蒸餾水 加至500 ml，調(diào)pH至7.4）對大鼠進(jìn)行全身固定。待動物全身僵硬后，取左心室相關(guān)組織，再用4%戊二醛固定液浸透法固定材料，制備成1 mm3樣品。之后送電鏡中心進(jìn)行鏡下觀察和拍照。

1.6線粒體呼抽取及呼吸功能檢測

心肌組織切碎后，在4 ℃介質(zhì)（0.25 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl pH=7.4，0℃～4℃）中制備心肌組織勻漿。勻漿首先經(jīng)750 g離心10 min后留上清，之后，以9 000 g離心20 min后留沉淀，重新懸浮后以9 000 g再離心20 min，棄上清得線粒體。全部操作于4 ℃進(jìn)行。線粒體呼吸功能用氧耗儀 （YSI，Ohio，USA）測定，方法參考Bo等方法[22]。簡要如下：反應(yīng)體系在一個3 ml封閉的帶磁力攪拌器的玻璃槽內(nèi)進(jìn)行，其中包含130 mM KCl，3.0 mM HEPES，0.5 mM EDTA，2.0 mM KH2PO4，1 mg/ml BSA和2 mg線粒體蛋白，pH值為7.4，反應(yīng)溫度為25℃。當(dāng)線粒體置于反應(yīng)槽后，首先平衡3 min，之后向反應(yīng)槽中加入1 mM谷氨酸鹽及終濃度為0.1 mM蘋果酸，以啟動線粒體呼吸。在加入200 nM ADP后，線粒體進(jìn)入三態(tài)呼吸。當(dāng)呼吸曲線出現(xiàn)明顯拐角時，提示呼吸過程進(jìn)入四態(tài)。線粒體呼吸控制率用三態(tài)呼吸除以四態(tài)呼吸的比值表示。加入的ADP除以氧耗量，即：磷氧比值 （P/O）表示線粒體能量合成水平。

1.7Western Blot 印跡檢測各組大鼠心肌組織蛋白表達(dá)

選取-80℃冰箱凍存的心肌組織～120 mg，經(jīng)超聲粉碎，勻漿，變性，定量（BCA法）后，各取25 μg蛋白用于蛋白表達(dá)的印跡檢測。簡要如下：25 μg蛋白經(jīng)8%～12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，通過轉(zhuǎn)膜儀 （DYCZ-25D，北京沃德仁和生物）將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜。之后，蛋白與對應(yīng)一抗（Pgc-1α，COX I，II，III，IV，V，Atg5，Bclin-1，兔抗大鼠單克隆抗體按照體積比為1：2000稀釋；Mfn1，Mfn2，Drp1，Opa1，Lc3B單克隆抗體按照體積比為1：1000稀釋）反應(yīng)（4℃過夜或常溫6 h）混合孵育。膜經(jīng)封閉、洗脫（5 min×3）后，再和對應(yīng)的二抗孵育。洗脫二抗（5 min×3），用發(fā)光液（ECL）發(fā)光，X光片曝光顯像。采用圖像分析軟件Quantity one （Bio-Rad，California，USA）作灰度分析統(tǒng)計。分析過程按照以下步驟進(jìn)行：首先根據(jù)條帶位置創(chuàng)建泳道，用背景分析及區(qū)域分布進(jìn)行泳道背景的排除，接下來進(jìn)行條帶創(chuàng)建，最后進(jìn)行高斯建模與結(jié)果分析。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

采用PASW SPSS 20.0 （IBM，Armonk，New York，USA）分析結(jié)果，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（M± SD）表示。組間比較用單因素方差分析（Student's t-test or ANOVA），P< 0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異。GraphPad Software Prism 6.01（GraphPad Software，La Jolla，California，USA）統(tǒng)計作圖。

2結(jié)果

2.1羥基酪醇對SD大鼠心肌組織線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

為了檢測HT對心肌組織線粒體功能的影響，首先用透射電鏡觀察線粒體形態(tài)學(xué)的變化。圖1結(jié)果顯示，CON組心肌纖維排列整齊，肌絲光滑完整；線粒體輪廓清晰，內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)完整。HT組線粒體形態(tài)與CON組相似，密度有所增加。ET組大鼠線粒體發(fā)生腫脹，水性變及空泡化，內(nèi)膜、嵴破壞溶解改變。HT可減輕上述病理性變化，如減少膜結(jié)構(gòu)損傷，維持嵴形態(tài)，減少內(nèi)容物溶解及空泡化等。

形態(tài)決定功能。ET引起的線粒體形態(tài)學(xué)的改變必定會造成其功能發(fā)生變化。接下來，檢測了線粒體呼吸功能的變化。如圖2所示，與對照組相比，過度訓(xùn)練造成線粒體三態(tài)呼吸水平降低和四態(tài)呼吸水平升高，從而造成線粒呼吸比率 （RCR=State3/State 4）降低，P/O水平也顯著性降低（P<0.05）。雖然HT可提高線粒體三態(tài)呼吸和P/O水平（P<0.05），但對RCR并不具有顯著性影響。

3討論

本研究結(jié)果顯示，過度訓(xùn)練可以引起心肌組織線粒體呼吸功能紊亂，其原因部分是由于ET對心肌線粒體動力學(xué)及自噬相關(guān)蛋白的病理性重塑。HT可有效維持線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整及呼吸功能正常。其可能是通過抑制線粒體動力學(xué)蛋白病理性重塑及減低自噬水平而實現(xiàn)。下面將從HT對動力學(xué)蛋白的重塑及自噬調(diào)節(jié)兩方面展開討論。

3.1HT抑制ET對動力學(xué)蛋白的病理性重構(gòu)作用

過度訓(xùn)練可造成心肌損傷。彭等研究指出，ET可造成心肌能量代謝酶（CK、LDH、SDH）及ATP酶的活性水平降低，同時還造成心肌組織抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）水平降低[2]。容等研究顯示，ET可造成過度訓(xùn)練大鼠心肌細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)[25]。而上述病理性變化均和線粒體功能異常密切相關(guān)。本研究顯示，ET可造成線粒體結(jié)構(gòu)損傷和功能異常（RCR降低，P/O下降及復(fù)合物蛋白I，IV，V表達(dá)降低）（圖1和圖2）。相對地，HT可有效抑制或逆轉(zhuǎn)這些病理性變化。

線粒體融合蛋白（Mfn）主要內(nèi)膜融合蛋白及外膜融合蛋白所構(gòu)成。其中，外膜融合蛋白由有Mfn1和Mfn2亞型構(gòu)成，完成線粒體融合過程中的外膜融合。而Opa1主要是在內(nèi)膜融合過程中發(fā)揮作用。線粒體裂解過程主要有Drp1所主導(dǎo)。Drp1位于細(xì)胞漿，當(dāng)線粒體受損，可轉(zhuǎn)位到線粒體與Fis1蛋白結(jié)合介導(dǎo)裂解事件的發(fā)生。適度的溶解和裂解對于維持線粒體正常功能，如結(jié)構(gòu)的完整性，ETC蛋白活性，呼吸耦聯(lián)，氧化磷酸化水平及能量輸出等，發(fā)揮重要作用[14]。一旦上述穩(wěn)態(tài)被打破，即可引起多種疾病，如心血管疾病[16]、二型糖尿病[23]等。相對地，過表達(dá)線粒體融合蛋白Mfn1/2 及Opa1，則可有效抑制心血管疾病的發(fā)生[26]。本研究顯示，ET可造成線粒體融合降低及裂解增多。該結(jié)果和過度訓(xùn)練對骨骼肌的影響相似[20]。推測，這可能是機體的一種自我保護(hù)機制，因為線粒體片段結(jié)構(gòu)的增多能夠加速糖原和丙酮酸的利用，遏制氧化磷酸化功能降低。然而，上述變化雖然可能代償性的加速線粒體在細(xì)胞內(nèi)的運動速率（到達(dá)能量需要部位），但過度裂解可造成線粒體碎片結(jié)構(gòu)增加（結(jié)構(gòu)不完整），從而降低線粒體功能。就運動應(yīng)激與線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的相關(guān)基因表達(dá)而言，不同的運動方式產(chǎn)生各異的影響效果。一次或重復(fù)進(jìn)行的耐力訓(xùn)練可對相關(guān)基因和蛋白產(chǎn)生良性作用效果，如增加細(xì)胞氧耗，提高復(fù)合物蛋白活性及增加線粒體生物合成等[27]。然而，過度訓(xùn)練，如本研究所示，可造成線粒體生物合成水平降低，能量合成下降 （圖3、圖4）。就調(diào)節(jié)機制而言，新近研究顯示，Pgc-1α對動力學(xué)的相關(guān)基因發(fā)揮調(diào)控作用[28]。然而具體調(diào)節(jié)機制尚不明確。另外，有研究指出，ROS參與了線粒體的裂解過程[29]，ET造成的線粒體功能異常可能與其引起的氧化應(yīng)激損傷相關(guān)。

與對照組相比，HT可部分提高線粒體融合及下調(diào)裂解水平。但具體調(diào)節(jié)機制尚不清楚。近年來研究證實，Pgc-1α參與了對融合和裂解的調(diào)節(jié)過程[30]。本研究證實，HT可提高Pgc-1α表達(dá)水平（圖3）。這和之前相關(guān)研究結(jié)果一致[31]。關(guān)于HT對Pgc-1α的調(diào)節(jié)作用，有研究指出主要是通過提高AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）蛋白的磷酸化水平[32]而實現(xiàn)。另外，HT的抗氧化作用可能是其降低裂解的原因之一[31]。HT不僅能夠活化AMPK，增加叉頭蛋白（FOXO）3a向細(xì)胞核內(nèi)的定位，上調(diào)線粒體抗氧化酶，如：過氧化氫酶（catalase），錳SOD （MnSOD）等[15]，還可促進(jìn)KELCH狀ECH-相關(guān)蛋白1（Keap1）與核呼吸因子（Nrf）2的解離，加速Nrf2的核定位而轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)二相抗氧化酶的表達(dá)水平[33]。

3.2 HT降低ET引起自噬水平升高

自噬是一個吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，藉此實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。研究顯示，眾多疾病的發(fā)生都伴隨著自噬水平的異常變化，如癌癥[34]、原發(fā)性高血壓[35]、衰老[24]等。就運動對自噬的影響，其主要決定于不同的運動方案。研究證實，中等強度的耐力訓(xùn)練可有效提高自噬水平[36-37]，并認(rèn)為自噬水平的上調(diào)是運動引起保護(hù)作用的重要機制之一。然而，過度訓(xùn)練狀態(tài)下自噬水平的變化如何，尚未見到相關(guān)報道。本研究首次證實，過度訓(xùn)練可造成心肌線粒體自噬水平異常升高（過度自噬，對正常線粒體形態(tài)和功能構(gòu)成威脅），這可能是其造成線粒體功能異常的重要原因之一，但具體機制尚不清楚。有研究指出，過度訓(xùn)練可上調(diào)Foxo3a表達(dá)水平，提高自噬水平[20]。另有研究顯示，氧化應(yīng)激信號通路的激活是造成過度自噬發(fā)生的重要機制[34， 38]。提示，過度訓(xùn)練引起的氧化應(yīng)激損傷可能是造成自噬水平異常的潛在機制。HT被證實能夠?qū)Ω鞣N病例狀態(tài)下自噬水平產(chǎn)生積極影響[20， 39-40]。本研究也證實，HT可有效降低ET引起的線粒體過度自噬（圖5）。提示，HT對自噬的調(diào)節(jié)具有雙向性。雖然HT可通過c-Jun氨基末端激酶（JNK） -p62信號通路增加二相抗氧化酶[41]，但有研究指出HT可失活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2-JNK通路抑制自噬[34]。所以，HT介導(dǎo)的抗氧化作用對自噬的影響機制仍需進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

ET可造成心肌組織線粒體損傷及呼吸功能異常，該病理性變化與動力學(xué)蛋白異常重塑及自噬水平提高相關(guān)。HT可有效維持線粒體結(jié)構(gòu)完整及功能正常，其作用機制可能是通過，至少部分通過維持動力學(xué)蛋白正常表達(dá)及降低自噬。提示，HT可作為預(yù)防和治療ET引起的心肌線粒體功能紊亂的有效方法。

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