大鼠骨質疏松骨折局部注射辛伐他汀對愈合的影響

冀瑞鋒 韓樹峰

大鼠骨質疏松骨折局部注射辛伐他汀對愈合的影響

冀瑞鋒 韓樹峰

目的 觀察不同劑量辛伐他汀溶液對于骨質疏松大鼠股骨骨折愈合的影響。方法 3月齡健康雌性大鼠45只分為5組（n=9），手術組（A）；卵巢切除組（B）；骨質疏松骨折組（C）；骨質疏松性骨折+辛伐他汀1組（D）;骨質疏松性骨折+辛伐他汀2組（E），A組大鼠僅實施假手術不切除雙側卵巢，其余B～D組均要求切除雙側卵巢。C、D、E組在切除雙側卵巢8周后，制左側股骨中段橫行骨折模型，D組在骨折局部注射5mg/(kg·d)辛伐他汀溶液，E組注射10mg/(kg·d)辛伐他汀溶液，C組注射不含辛伐他汀的空載體，A、B組在術后8周處死，取出完整左側股骨，其余3組在骨折造模后4周處死，并取出全部左側股骨，測定左側股骨的骨密度、HE染色并光鏡下觀察。結果 （1）切除卵巢8周后，測定B組骨密度顯著低于A組（P＜0.05）。（2）骨質疏松骨折3組，C、D、E組的pBMD、mBMD、dBMD、tBMD均顯著高于C組（pBMD：F=16.94，P=0.001；mBMD：F=15.57，P=0.001；dBMD：F=24.77，P=0.001；tBMD：F=23.46，P=0.001），D、E 2組中E組各部分骨密度值均高于D組，且有統計學意義（P＜0.05）。（3）形態學觀察：HE染色后觀察，D、E組較C組而言有較多的板層骨形成，并且D、E組中有較多量的軟骨細胞存在，C組中幾乎不可見板層骨存在，軟骨細胞數量較少，提示D、E組較C組愈合快。結論辛伐他汀溶液皮下注射可以明顯加速骨質疏松骨折愈合的進程，而且不同濃度的辛伐他汀溶液對骨質疏松骨折愈合的影響不同。高劑量明顯比低劑量效果更為顯著。

骨質疏松；骨折；骨折愈合；辛伐他汀

隨著全球人口結構老齡化的矛盾的突顯,一系列老年疾病成為困擾老年人健康的主要問題。骨質疏松作為一種老年性全身性疾病,以骨量減少,骨微結構破壞,骨韌性降低脆性增加為主要特征。骨質疏松后骨折成為最常見的并發癥。骨質疏松后骨折在臨床上有治療困難,愈合較慢等一系列問題,嚴重影響骨折的預后及患者生活質量。有研究表明老年患者髖部骨折后第1年死亡率高于43%,5年死亡率超過75%[1]。骨質疏松骨折后內固定困難,容易出現內固定失敗[2]。骨質疏松治療中多為口服抑制骨質吸收類藥物,如二磷酸鹽等防治骨量進一步丟失,但骨質疏松治療過程中服藥周期長,不良反應大,患者長期服藥的依從性較低[3]。目前骨質疏松治療中主要是補充鈣及維生素D連用、二磷酸鹽、雌激素替代、降鈣素等治療,但并發骨折后這些藥物往往不能及時快速起效促進骨折愈合。尋找有效古今骨折愈合藥物是治療骨質疏松骨折的當務之急。

近年來研究發現的常用降脂藥辛伐他汀有促進成骨的作用,可以有效促進骨形態發生蛋白BMP-2的表達增強,從而有效增加骨量,減少骨量丟失[4]。本次試驗嘗試在骨質疏松大鼠左側股骨骨折局部皮下注射不同濃度辛伐他汀溶液來觀察其對骨質疏松骨折愈合情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和設備

1.1.1 試劑 辛伐他汀分散片（批號：3137185,廣州市南新制藥有限公司,中國）；二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide, DMSO,sigma公司,美國）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA,Roche公司,瑞士）；青霉素（批號：s1209409,華北制藥,中國）。

1.1.2 設備 雙能X線骨密度儀（DEXA,型號：Disco very-Wi,Hologic公司,美國）。

1.1.3 實驗動物 3月齡的健康雌性Wistar大鼠45只（山西醫科大學生理實驗室提供）,體質量250～300g。

1.2 實驗方法

1.2.1 辛伐他汀注射液配置 將辛伐他汀粉碎后溶解于含有2%的DMSO與0.1%的BSA的PBS混合液中[4]。濃度為

5mg/mL與10mg/mL。同時配置不含辛伐他汀的空載體,并用60Co輻照滅菌。

1.2.2 大鼠處理及分組 45只大鼠隨機分為5組,每組

9只,假手術組（A）；卵巢切除組（B）；骨質疏松骨折組（C）；骨質疏松性骨折+辛伐他汀1組（D）；骨質疏松性骨折+辛伐他汀2（E）組。A組大鼠僅實施假手術不切除雙側卵巢,其余各組B～D組均要求切除雙側卵巢,術后給予大鼠肌注80萬單位青霉素

BID。C、D、E組在切除雙側卵巢8周后,制股骨中段橫行骨折模型。術后給予大鼠肌注80萬單位青霉素BID。骨折術后當天即開始骨折局部皮下注射辛伐他汀溶液,連續皮下注射7d。D組在骨折局部注射5mg/(kg·d)辛伐他汀溶液,E組注射10mg/ (kg·d)辛伐他汀溶液,C組注射不含辛伐他汀的空載體。

A、B2組大鼠在術后飼養8周后處死,取出左側完整股骨行DEXA檢測測量左側股骨的骨密度；其余各組于骨折模型后4周處死,取出完整左側股骨,并對其經行DEXA檢測,脫鈣后石蠟包埋并HE染色做組織切片觀察形態。

各組大鼠在相同環境下飼養,空氣濕度為30%～40%,溫度為21℃～23℃,12h.12h明暗交替環境下飼養。給予標準自由飲食,飲水為去離子水,飲食為標準固體飼料（由山西醫科大學動物中心提供）。

1.3 DEXA測量 應用DEXA機器,在高分辨率模式下對各組大鼠左側股骨經行骨密度測量,測量時取出固定用克氏針,將測量指標分為4項分別為整體骨密度值（tBMD）,股骨近端（上1/3）骨密度值（pBMD）,中段（中1/3）骨密度值（mBMD）,遠端（下1/3）骨密度值（dBMD）。

1.4 骨痂組織HE染色 將左側股骨骨折模型取出,10%多聚甲醛中固定48h,再將其取出,放入10% EDTA-2Na 緩沖液(pH7.4,4℃)脫鈣,隔天更換一次緩沖液,連續脫鈣2個月,待脫鈣完全以后,用梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋后以

5μm為寬度經行連續切片,行HE然后后封片,并于顯微鏡下觀察組織形態。

1.5 統計學方法 將實驗所得數據采用SPSS19.0統計軟件進行處理。正態計量資料采用“x±s”表示；2組正態計量數據的組間比較采用t檢驗。計數資料用例數（n）表示,計數資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗；利用單因素方差分析(ANOVA)及LSD檢驗比較各組之間的差異,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠死亡 B～E組切除雙側卵巢后由于術后感染,腹脹,其他不明原因造成的大鼠死亡分別為B組死亡2只,C組死亡1只,D組死亡2只,E組死亡2只。C,D,E組內固定后由于固定失敗或感染等因素造成死亡分別為C組2只,D組1只, E組1只。合計A組假手術組死亡1只,B組死亡2只,C組死亡3只,D組死亡3只,E組死亡3只。

2.2 骨質疏松造模檢測

2.2.1 A、B2組大鼠體質量 A組僅實施假手術手術部位及方式與B組相同,但不切除雙側卵巢,術后大鼠飲食飲水狀態較差,術后2d飲食恢復正常。2組大鼠在相同環境下飼養,飼養8周后,B組切除雙側卵巢的大鼠個頭明顯較A組大,B組體質量也較A組有明顯差異。

2.2.2 A、B2組骨密度測定 測定A/B 2組左腿的整體骨密度值,A組（0.2383±0.01000）g/cm2；B組（0.2062± 0.0158）g/cm2,B組較A組骨密度值顯著降低（P＜0.05）。

2.3 骨折組骨密度及組織切片

2.3.1 骨密度值測定 C、D、E組大鼠造左側股骨中段骨折的模型,并在骨折斷端進行局部皮下給與不同濃度的辛伐他汀溶液,左股骨骨密度值：D、E組均顯著高于C組（P＜0.05）；E組高于D組,差異有統計學意義（P＜0.05,見表1）。

2.3.2 組織形態學觀察 在HE染色后觀察,D、E組較C組而言有較多的板層骨形成,并且D、E組中有較多量的軟骨細胞存在,C組中幾乎不可見板層骨存在,軟骨細胞數量較少,提示D、E組較C組愈合快。

表1 各骨折組骨密度（g/cm2,n=6）

3 討論

3.1 骨質疏松及骨質疏松后骨折 世界衛生組織(WHO)關于骨質疏松癥(osteoporosis,OP)的定義是：以骨量減少、骨組織微結構破壞、骨脆性增加和易于骨折為特征的代謝性骨病,其組織病理學特點是單位體積內的骨量(bone mass)降低而骨礦物質與骨基質的比例仍正常或基本正常。全球范圍來說大約有超過7000萬人口的骨質疏松癥患者伴發有骨折的風險[4]。骨質疏松后骨質脆性增加,內固定穩定性差,臨床治療難度高。隨著近年來人口老齡化程度加重,骨質疏松癥及其并發骨折等一系列問題日益凸顯,成為威脅老年人健康的重要因素,骨質疏松后骨折造成的致死致殘率高,患者帶來身體創傷和經濟負擔加重。

3.2 他汀類藥物對骨質的作用 他汀類作為臨床上廣泛用于心血管疾病的預防用藥。Mundy G等研究發現他汀類有促進骨質生成的新藥理作用[5]。為其應用于骨質疏松治療提供了新的途徑。近年來他汀類應用于骨質疏松治療經行了研究,并提供大量證據。Song等研究辛伐他汀可以增加雌激素受體α的數量,并可以促進BMP-2的生成[6]。宋純理等研究發現在體外培養骨髓間充質干細胞使用辛伐他汀可以有效組織BMC成脂分化[7]。他汀類口服藥物需要經過肝臟代謝,而此類藥物肝臟的首過效應明顯,進入血液循環的藥物僅不足5%,到達骨折局部區域作用的血藥濃度更低[8],通過嘗試新的途徑給藥以尋求更有效的提高藥物利用的方法。Yin H等研究表明辛伐他汀可以減輕氧化應激反應并增加NO的生成,可以減輕H2O2對于細胞的損傷并增加ALP在成骨細胞的表達[9]。近年來有多種嘗試全新給藥方式的研究,王晶瑩等研究嘗試填充物混合辛伐他汀修復骨缺損[10]。楊寧等研究表明骨質疏松大鼠股骨內單次注射辛伐他汀可以強化骨骼[11]。這些都說明辛伐他汀對于骨質形成有明顯效果,本次實驗采用骨折斷端局部皮下注射辛伐他汀溶液,盡可能避免肝臟代謝引起的首過消除效應,加強局部斷端血藥濃度,從而進一步觀察不同局部藥物濃度對骨折愈合情況。為探索新的給藥方式提供一種可能。

研究結果顯示,對骨折各組間骨密度值進行比較后發現,局部注射辛伐他汀可以明顯增加局部骨密度值,組織切片也顯示出注射辛伐他汀有促進骨質愈合的作用。本實驗條件下對于不同濃度的辛伐他汀皮下注射有較顯著地促進骨質疏松骨折愈合的效果,不同劑量之間骨質疏松骨折愈合情況差異有統計學意義。

3.3 不足與展望 本實驗僅就不同濃度辛伐他汀溶液局部注射對骨折愈合影響做了研究,結果提示,辛伐他汀可以有效促進骨質疏松骨折愈合,為治療骨質疏松骨折提供可能的給藥途徑和劑量參考。但對于骨折局部注射在不同時間的作用效果未作進一步研究,無法明確更合理的用藥周期。隨著辛伐他汀后續研究進一步深入,相信在不久將來骨質疏松骨折的辛伐他汀治療將有更廣闊的應用前景。

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Objective To explore the effect of different dose simvastatin solution injected subcutaneously for femur fracture healing of osteoporotic rats. Methods Forty-five 3-mouths old female Wistar rats were randomly divided into 5 groups (n=9). Group A is the sham operation. B-E are the groups with rats which

ovariectomy. The rats in group A、B were sacrificed after 8 weeks under operation. The rats in group C, D and E were further used to establish open fracture models of femur and fixed with intramedullary nails 8 weeks after ovariectomy. C, D and E injected subcutaneously of Simvastatin solutions or vehicle (C with vehicle, D with 5 mg/(kg·d),E with 10mg/(kg·d)). The fractured rats were sacrificed 4 weeks after fracture. Bone mineral density were used to evaluate fracture healing quantitatively,and the femurs were then decalcified for HE staining and subsequent histological observation. Results The BMD of group B is significantly lower than group A after 8 weeks under ovariectomy （P＜0.05）. BMD of group D and group E are significantly increased than group C. The BMD of group E is significantly higher than group C. The rats in group D and E showed more mature callus with partially lamellar bone. The observation of histological showed the process of fracture healing of group C with vehicle was delayed. Conclusion The injection of simvastatin solutions can accelerate the process of fracture healing of osteoporotic rats. The highe dose of simvastatin solution can be more efficient than low.

Osteoporosis; Fracture; Fracture healing; Simvastatin

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.25.001

山西 030001 山西醫科大學第一醫院骨科（冀瑞鋒 韓樹峰）

韓樹峰 E-mail：drhanshufeng@sohu.com