腎上腺髓質素在急性壞死性胰腺炎并肝損傷大鼠肝組織中的表達

詹媛 唐國都 梁志海 唐曦平 李維維 張露藝

腎上腺髓質素(adrenomedullin，ADM)是1993 年從人的嗜鉻細胞瘤中發現的一種活性肽。它是機體內重要的內源性保護物質，能抑制促炎性反應細胞因子的分泌，降低由內毒素或細胞因子引起的內皮細胞通透性增高[1]。研究表明，ADM通過與其受體結合發揮多種生理效應[2]。本研究觀察急性壞死性胰腺炎(ANP)并肝損傷大鼠肝組織中ADM mRNA的表達變化。

材料與方法

一、實驗動物及分組

SD大鼠64只，清潔級，雄性，體質量250～300 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。適應性喂養1周后按完全隨機法分為對照組和ANP組，每組32只。采用膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉(日本TCI公司)1 ml/kg體質量的方法制備ANP模型。對照組剖腹輕翻動胰腺組織后關腹。術后第3、6、12、24 h分批處死大鼠。采血并分離血清；取胰腺和肝組織部分用10%甲醛固定，部分置-80℃冰箱保存，部分放入RNA保存液，置-20℃冰箱保存。

二、觀測指標及檢測方法

1．血清淀粉酶、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、ADM檢測：淀粉酶、ALT、AST濃度由全自動生化分析儀測定，ADM水平采用ELISA試劑盒測定，按說明書操作。。

2．胰腺與肝組織病理學檢查：固定的胰腺及肝組織常規脫水、包埋、切片及HE染色，由病理科醫師盲法光鏡下讀片。參考Schmidt等[3]標準從水腫、出血、壞死及炎癥細胞浸潤4個方面對胰腺進行評分；參考Camargo等[4]標準從肝細胞變性或壞死、炎癥、血管擴張3個方面對肝組織進行評分。

3．肝臟組織ADM mRNA檢測：采用熒光定量PCR法。用Trizol試劑(Omega公司)提取組織總RNA。ADM引物序列：上游5′-CTCACCCTTTCAGCAGGGTA-3′，下游5′-CACGACTTAGCGCCCACTTA-3′，擴增片段162 bp，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。GAPDH(內參)引物序列：上游5′-CATGGTCTACATGTTCCAGT-3′，下游5′-GGCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3′，擴增片段349 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR條件：95℃10 min，95℃ 15 s、62℃45 s， 40個循環。采用公式2-△△Ct計算肝臟組織ADM mRNA表達量。

三、統計學處理

結 果

一、血清淀粉酶、ALT、AST、ADM的變化

ANP組大鼠血清淀粉酶濃度于造模后3 h明顯上升，6 h達峰值，并持續處于高水平狀態；ALT濃度隨著時間推移逐漸上升；AST濃度于造模后3 h上升，6 h達峰值，并持續處于高水平狀態；血清ADM濃度于造模后3 h上升，12 h達峰值，并持續處于高水平狀態。ANP組血清淀粉酶、ALT、AST、ADM水平均較同時點對照組升高，差異有統計學意義(t值范圍：-2.485～-11.364，P<0.05或<0.01，表1)。

二、胰腺、肝臟組織病理改變

對照組大鼠胰腺大體無明顯改變；鏡下見胰腺偶有輕度水腫及少量炎細胞浸潤。ANP組大鼠胰腺明顯水腫，有暗紅色出血并膠凍樣壞死；鏡下見胰腺間質增寬，腺小葉結構破壞，腺泡細胞空泡樣變，炎性細胞浸潤，局灶或大片出血壞死。ANP組胰腺病理分值均較同時點對照組顯著升高，差異有統計學意義(t值分別為-13.560、-16.615、-15.339、-8.327，P值均<0.01，表2，圖1a)。

表1 各組血清淀粉酶、ALT、AST、ADM濃度的變化

對照組大鼠肝臟大體無明顯改變；鏡下未見明顯變化。ANP組大鼠肝臟大體無明顯改變；鏡下見肝小葉基本完整，肝細胞濁腫，匯管區可見淋巴細胞浸潤，血管擴張。ANP組肝臟病理評分均較同時點對照組顯著升高，差異有統計學意義(t值分別為-11.068、-11.180、-6.500、-9.000，P值均<0.01，表2，圖1b)。

表2 各組胰腺、肝臟的病理評分

圖1 對照組(左)、ANP組(右)胰腺(a)、肝臟(b)的病理改變(HE ×200)

三、肝組織ADM mRNA表達

對照組大鼠術后3、6、12、24 h肝組織ADM mRNA表達量分別為0.81±0.47、1.04±0.20、1.12±0.49、0.90±0.88；ANP組分別為1.71±0.39、3.00±1.49、1.60±0.58、2.00±0.83。ANP組肝組織ADM mRNA表達量在3 h升高，6 h達到峰值，之后稍有下降，但均較同時點對照組顯著升高，差異具有統計學意義(t值分別為-5.713、-5.547、-2.588、-3.319，P<0.05或<0.01)。

討 論

自從1993年Kitamura等發現ADM之后，研究表明它有多種生物學功能，包括擴張血管、降低血壓、抑制血管平滑肌增殖、舒張支氣管、抑制氣道重塑、利鈉、利尿、參與神經調節、抑制促腎上腺皮質激素(ACTH)和胰高血糖素的釋放、減弱促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)的效應以及增加胰島素和C肽的分泌等[2,5]。此外， ADM具有調節免疫的功能。Kubo等[6]研究發現機體內的淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞以及小膠質細胞等免疫細胞均能合成分泌ADM，并具有ADM受體。巨噬細胞分泌的ADM量與分化程度有關。Marutsuka等[7]研究表明人類結腸黏膜分泌的ADM能殺滅大腸桿菌。ADM還有炎癥調節作用，它能抑制致炎因子釋放、降低炎性滲出。在內皮生長因子刺激下血管內皮細胞的細胞間黏附分子1、血管細胞黏附分子1、E型內皮細胞選擇素等mRNA上調，ADM抑制這種上調并降低血管內皮細胞與白細胞的黏附[8]。內源性ADM在嚴重感染包括膿毒癥和膿毒性休克患者的血液中是升高的[9]，同時能夠成為維持微血管內皮功能的穩定劑[10]。Elsasser等[5]研究表明，ADM基因表達的上調和ADM在全身循環和局部組織內水平增加是與創傷、感染、敗血癥的發病和進展相一致的。

急性胰腺炎(AP)是胰腺的急性炎性病變，早期的胰酶活化及炎性遞質、細胞因子和氧自由基大量產生引發的炎癥反應是造成AP早期病理損害的主要原因。Onur等[1]的研究表明,ADM在AP發病過程中對胰腺有保護作用，可能與ADM抑制促炎因子分泌，降低由內毒素或細胞因子引起的內皮細胞通透性增高等因素有關。肝臟是AP時胰腺外主要受損和最早發生改變的器官，在誘導大鼠發生AP后6～12 h就出現肝臟結構和功能的急性損傷，而肺臟和腎臟未出現改變[11]。AP時胰腺組織產生的TNF-α通過門靜脈進入肝臟，導致肝組織炎癥因子的產生和活化[12]，刺激肝巨噬細胞分泌細胞因子，其瀑布級聯效應使肝細胞受到持續性的結構和功能損害，細胞膜通透性增加，細胞內AST、ALT等大量滲入血液，導致肝臟對毒性物質、生物活性物質的解毒和清除能力明顯下降。肝臟釋放的大量炎癥細胞因子通過肝臟屏障進入體循環，加重了AP病情，并造成全身其他器官的損害。Gloor等[13]報道，阻斷肝巨噬細胞功能可抑制血清TNF-α水平的上升及肺中性粒細胞的浸潤，減輕AP相關的肺損害[14]。ADM可以降低炎癥因子IL-1、TNF-α、TNF-β的釋放[15]保護AP時的肝損傷。

本研究結果顯示，ANP組大鼠血清ADM濃度與肝組織ADM mRNA表達量在3 h時即升高，提示ANP并肝損傷的早期ADM基因表達就增高，這或許可以作為評估ANP并肝損傷的指標，為AP并肝損傷的診斷提供新的思路。

參 考 文 獻

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