Rho-GDI2在胰腺癌中的表達及其臨床意義

易彬 張逸 周健 宋世鐸 趙鑫 李德春

Rho-鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPases)蛋白家族，包括RhoA、RAC1和Cdc42，具有調控一系列調節生物過程的信號通路、參與促進所有腫瘤的惡性生物學行為等作用[1-2]。

鳥嘌呤核苷酸解離抑制因子2(Rho-GDP dissociation inhibitor2，Rho-GDI2)作為Rho-GTPases蛋白家族的重要調節因子之一，通過調節Rho-GTPases蛋白家族的分布及活性狀態，從而影響細胞的分裂、形態改變、遷移及侵襲能力、血管侵犯等生物學行為[1,3-5]。然而，關于Rho-GDI2的表達與胰腺癌臨床病理參數間的關系鮮見報道。本研究檢測胰腺癌及配對癌旁組織中Rho-GDI2的表達，分析胰腺癌組織Rho-GDI2表達與臨床病理參數間的關系，探討Rho-GDI2在胰腺癌發生及發展中的作用。

材料與方法

一、實驗材料

收集2006年至2012年蘇州大學附屬第一醫院手術切除并經病理證實的60例胰腺癌及其配對癌旁組織，部分用甲醛固定，部分置液氮罐凍存后轉入-80℃冰箱保存。Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自Thermo公司，Master MixPCR擴增試劑盒購自美國Promega公司，兔抗人Rho-GDI2多抗購自英國Abcam公司,山羊抗兔二抗購自碧云天生物技術(上海)有限公司。PCR引物采用PremierPrimer 5．0軟件設計，由美國Invitrogen公司合成。

二、方法

1．RNA提取和RT-PCR：取20例新鮮凍存胰腺癌組織及配對癌旁組織，用Trizol提取總RNA，隨后用AMV逆轉錄試劑盒合成cDNA，再行RCR擴增。引物序列：Rho-GDI2上游5′-ATGACTGAAAAAGCCCCA-3′，下游5′-TCATTCTGTCCACTCCTT-3′。內參β-actin上游5′-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3′，下游5′-CAGGGTACATGGTGGTGCTGCC-3′。PCR反應條件：95℃ 10 min，95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環，最后72℃ 7 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠自動成像儀拍照，灰度掃描，使用Quantity One軟件分析，以目的基因條帶與β-actin條帶灰度值比表示mRNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。

2．免疫組織化學染色：固定的組織經石蠟包埋、切片，行常規免疫組織化學染色。Rho-GDl2一抗及二抗工作濃度1∶50稀釋，最后DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明和封片。染色的組織切片由兩名病理科醫師盲法讀片。結果判斷：以細胞內出現棕黃色顆粒為陽性染色，染色強度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別計0、1、2、3分，陽性著色面積按無著色及著色面積<1/3、1/3～2/3、>2/3分別計0、1、2、3分，將兩項得分相加，>3分為表達陽性。

三、統計學處理

結 果

一、胰腺癌及配對癌旁組織Rho-GDI2 mRNA表達

20例胰腺癌組織及相應癌旁組織中Rho-GDI2 mRNA表達量分別為0.661±0.021、0.199±0.023(圖1)，癌組織顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(F=26.313，P<0.01)。

圖1 胰腺癌(T)及配對癌旁組織(NT)Rho-GDI2 mRNA的表達

二、胰腺癌及配對癌旁組織Rho-GDI2蛋白表達

Rho-GDI2陽性染色主要定位于細胞胞質內，少部分陽性染色定位于胞核(圖2)。胰腺癌組織Rho-GDI2陽性表達率為73.3%(44/60)，且陽性染色多呈棕黃色或棕褐色；配對癌旁組織的陽性表達率為41.7%(25/60)，且陽性染色多呈淡黃色。胰腺癌組織Rho-GDI2蛋白陽性表達率顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(χ2=12.310，P=0.001)。

圖2 胰腺癌組織(a)及癌旁組織(b)中Rho-GDI2蛋白的表達 (免疫組化 ×400)

三、胰腺癌組織Rho-GDI2表達與臨床病理參數的關系

胰腺癌組織Rho-GDI2蛋白表達與患者性別、年齡及腫瘤部位無相關性，而與腫瘤大小、分化程度、病理分期、淋巴結轉移、血管侵犯等具有相關性(表1)。

表1 胰腺癌組織Rho-GDI2的表達與臨床病理參數的關系

討 論

Rho-GDIs作為Rho-GTPases蛋白家族的重要調節因子，目前被確認的有3種：Rho-GDI1(也稱作Rho-GDI或Rho-GDI-a)、Rho-GDI2(也稱為Ly-GDI或D4GDI或Rho-GDI-β)、Rho-GDI3(也稱為RhoGDI-γ)[6-8]。Rho-GDI1表達于哺乳類動物的各臟器，Rho-GDI3表達于大腦、肺臟、腎臟、睪丸以及胰腺，Rho-GDI2一直以來被認為特異性地表達于造血組織。近來研究發現Rho-GDI2在非造血組織腫瘤中也表達[9-11]。

Rho-GTPases家族有兩種結合狀態：(1)激活狀態：與GTP結合，定位于細胞膜，接受、傳遞、處理相應的信號刺激；(2)失活狀態：與GDP結合，定位于細胞質中，不能接受、傳遞、處理信號刺激。RhoGDI2通過抑制GDP與Rho-GTPases的解離，與大多數Rho-GTPases結合于細胞質中，使Rho-GTPases處于失活狀態，阻止其與效應分子相互作用，因此，Rho-GDI2最初被認定為Rho-GTPases蛋白家族的負調控因子。然而最近的研究表明，Rho-GDI2也可以與Rho-GTPases結合于細胞膜，通過抑制Rho-GTPases本身的GTPase活性以及GTPase激活蛋白(GAPs)的GTP酶活性，維持Rho-GTPases與GTP結合的激活狀態，對Rho-GTPases蛋白家族起正調控作用[12-15]。

腫瘤組織Rho-GDI2表達與其臨床病理參數及患者預后關系的研究結果在不同腫瘤中不一致。有研究報道，Rho-GDI2表達水平與膀胱癌患者生存率呈正相關，且是膀胱癌轉移及預后的獨立預測因子[16]。乳腺癌患者的無病生存率和無遠處轉移生存率與Rho-GDI2的表達呈負相關，提示Rho-GDI2高表達有促乳腺癌轉移的作用，是患者預后差的標記[17]。Rho-GDI2 mRNA低表達與胃癌淋巴結轉移及大腸癌肝轉移呈正相關，高表達Rho-GDI2的腫瘤患者有著更長的無腫瘤復發生存期[18-19]。

本研究結果顯示，胰腺癌及癌旁組織均有Rho-GDI2的表達，但癌組織的陽性表達率顯著高于相應配對癌旁組織，癌組織Rho-GDI2 mRNA表達量也顯著高于配對癌旁組織。胰腺癌組織Rho-GDI2蛋白表達與患者性別、年齡及腫瘤部位無相關性，而與腫瘤大小、分化程度、病理分期、淋巴結轉移、血管侵犯等相關，提示Rho-GDI2的表達與胰腺癌的轉移密切相關。

參 考 文 獻

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