慢性乙型肝炎患者外周血調節性B細胞與調節性T細胞的表達頻率及其相關性

楊鴻林，金潔，蔣廷旺

（1.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013；2.吳江區第一人民醫院檢驗科，江蘇蘇州215200；3.常熟市醫學檢驗所，江蘇蘇州215500）

慢性乙型肝炎患者外周血調節性B細胞與調節性T細胞的表達頻率及其相關性

楊鴻林1，2，金潔1，蔣廷旺3

（1.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013；2.吳江區第一人民醫院檢驗科，江蘇蘇州215200；3.常熟市醫學檢驗所，江蘇蘇州215500）

目的：分析慢性乙型肝炎患者外周血IL-10＋CD19＋調節性B細胞（regulatory B cells，Breg）與CD4＋CD25high調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）的比例及兩者的相互作用。方法：收集急性乙肝（acute hepatitis B，AHB）患者28例，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者31例和健康體檢者（健康組）25例。分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），經CpG ODN 2006和佛波酯體外作用后，流式細胞術分析Breg、Treg的表達及其相關性，ELISA檢測培養上清IL-10水平。通過免疫磁珠剔除CD4＋CD25＋T細胞后分析Breg與Treg表達頻率間的相關性。結果：CpGODN 2006和佛波酯作用后CHB組Breg和Treg百分率較AHB組和健康組均明顯升高（Breg：P值分別為0.003和0.001；Treg：P值分別為＜0.001，0.005），AHB組和健康組間兩類細胞表達頻率差異無統計學意義（Breg：P＝0.796；Treg：P＝0.227）；Spearman相關性分析顯示CHB組Breg與Treg表達百分比存在正相關關系（r＝0.50，P＝0.004），而AHB組和健康組無此相關性（r＝－0.15，P＝0.462；r＝0.09，P＝0.669）。CHB組IL-10表達高于AHB組和健康組（Z值分別為－6.596、－6.373，P均＜0.001），AHB組和健康組間差異無統計學意義（Z＝－0.952，P＝0.341）。Spearman相關性分析表明CHB組IL-10與Breg存在正相關關系（r＝3.303，P＝0.005）。CHB組患者Breg和IL-10的表達在剔除CD4＋CD25＋T細胞前后間的差異無統計學意義。結論：Breg和Treg在CHB患者中表達頻率升高，Breg可能通過IL-10的分泌參與慢性乙肝的免疫調節，且該作用不依賴于Treg。

調節性B細胞；慢性乙型肝炎；調節性T細胞；IL-10

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）進入人體后，細胞免疫應答在病毒清除過程中發揮了重要作用。研究發現，HBV慢性感染患者特異性T細胞免疫應答往往受到抑制，對病毒呈現免疫低反應性，但是其確切的機制仍不清楚［1－2］。

B細胞在自身免疫病、感染、腫瘤等疾病中具有調節T細胞應答的功能，而多項研究提示IL-10可能是B細胞發揮免疫調節作用的主要介質［3－4］。這種能夠分泌IL-10的B細胞近年來被命名為調節性B細胞（regulatory B cells，Breg）［5］。然而，Breg在HBV感染過程中的免疫調節作用目前報道較少，且機制尚不明確。本研究旨在探討Breg和調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）在慢性乙肝中的表達頻率及其相關性。

1 對象與方法

1.1 對象

急性乙型肝炎（acute hepatitis B，AHB）和慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的臨床診斷參考2000年中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯合修訂的《病毒性肝炎防治方案》中的急性乙肝和慢性乙肝診斷標準［6］。選擇AHB患者28例，CHB患者31例。健康對照組選擇年齡性別相匹配的健康體檢者25例。所有研究對象排除甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒和艾滋病病毒的交叉感染且無自身免疫性疾病。

1.2 細胞培養

抽取患者及對照者外周血10 mL，EDTA-K3抗凝，立即用淋巴細胞分離液（上海國藥公司）分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），RPMI 1640培養基（10%胎牛血清，4 mmol／L谷氨酰胺，100 U／mL青霉素，100μg／mL鏈霉素）調整PBMC至1×106／mL，培養于24孔板中。培養液中加入免疫佐劑CpG ODN 2006（上海生工生物技術公司）至0.1μmol／L，作用72 h后再以5 ng／mL佛波酯（PMA）作用6 h。

1.3 流式細胞分析

收集培養的細胞以2 mL預冷磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌2次。應用以下抗體進行胞內和胞膜染色：IL-10-PE，CD19-APC，CD4-FITC，CD25-PE（均購自美國BD公司）。未經刺激的細胞和同型對照用于反映染色的特異性。以FACSCalibur四色流式細胞儀及CellQuest Pro軟件（美國BD公司）獲取并分析IL-10＋CD19＋Breg和CD4＋CD25highTreg的表達頻率。

1.4 ELISA法測定PBMC培養上清中IL-10含量

收集PBMC細胞的培養上清，采用ELISA試劑盒（美國eBioscience公司）測定IL-10含量，操作按照說明書進行。

1.5 統計方法

以SPSS 17.0軟件進行統計分析，偏態分布資料用中位數和四分位數［M（P25-P75）］表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。兩組連續變量間的相關性采用Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-10＋CD19＋Breg和CD4＋CD25highTreg的表達頻率

各組患者PBMC經CpG ODN 2006和PMA作用后，結果顯示AHB組、CHB組和健康組Breg百分率分別為10.30%（7.05%～13.30%）、14.30%（10.70%～16.70%）和10.40%（6.85%～12.60%）。其中CHB組Breg的表達明顯高于AHB組和健康組（Z值分別為3.006和3.462，P值分別為0.003和0.001）；AHB組與健康組間的差異無統計學意義（Z＝0.258，P＝0.796）。見圖1。

CHB組CD4＋CD25highTreg的比例為5.80%（4.20%～9.10%），明顯高于AHB組［4.05%（2.53%～5.40%）］和健康組［4.50%（2.55%～5.50%）］（Z值分別為3.683和2.837，P值分別＜0.001和0.005）。健康組Treg比例與AHB組比較，差異無統計學意義（Z＝1.088，P＝0.227）。見圖2。

圖1 外周血PBMC經CpG作用后IL-10＋CD19＋B細胞占CD19＋B細胞的比例

圖2 外周血PBMC經CpG作用后CD4＋CD25high Treg細胞占CD4＋T細胞的比例

2.2 IL-10＋CD19＋Breg與CD4＋CD25highTreg表達頻率的相關性

CpG作用后，將各組IL-10＋CD19＋Breg與CD4＋CD25highTreg的表達頻率進行相關性分析發現，CHB組Breg與Treg的表達頻率間存在顯著相關性（r＝0.50，P＝0.004），而AHB組和健康組中Breg與Treg的表達頻率則無相關性（r＝－0.15，P＝0.462；r＝0.09，P＝0.669）。見圖3。

圖3 慢性乙肝組Breg與Treg表達頻率的相關性

2.3 CHB組IL-10的表達

體外刺激后，ELISA分析PBMC細胞培養上清，結果發現AHB組、CHB組和健康組的IL-10含量分別為5.8（0～7.5）pg／mL、26.7（21.3～33.5）pg／mL、6.4（5.0～8.2）pg／mL。CHB組IL-10的表達明顯高于AHB組和健康組（Z值分別為－6.596、－6.373，P均＜0.001）。AHB組和健康組間差異無統計學意義（Z＝－0.952，P＝0.341）。Spearman相關性分析表明，CHB組IL-10與Breg存在正相關關系（r＝3.303，P＝0.005），AHB組和健康組內無此相關性（r值分別為0.296、0.158，P值分別為0.127、0.450）。

2.4 CD4＋CD25＋T細胞清除前后Breg百分率和IL-10含量的變化

通過免疫磁珠法剔除10例CHB患者PBMC中CD4＋CD25＋T細胞后，進行同樣的體外刺激，結果如圖4所示，清除前后Breg百分率和細胞培養上清IL-10水平并無明顯變化（Z＝－0.038，－0.151；P＝0.970，0.880）。

圖4 慢性乙肝組Breg和IL-10表達在CD4＋CD25＋T細胞清除前后的變化

3 討論

我們分離患者PBMC并以CpG和PMA在體外活化其中的B細胞，發現體外刺激后CHB組患者Breg比例較AHB組和健康組明顯升高。CpG ODN是TLR9的配體，可以促進B細胞的活化和增殖，而相關研究表明CpG ODN具有促進初始狀B細胞與HBV表位結合的潛在作用［7］。由此可見，CHB患者的IL-10＋CD19＋Breg經體外誘導后相對于AHB患者和健康人增殖能力更強。Breg主要通過分泌IL-10對其他免疫細胞發揮免疫調節作用，通過抑制CD4＋T細胞的增殖和IFN-γ的分泌調節T細胞免疫應答。因此，我們分析了細胞培養上清中IL-10細胞因子的分泌情況，發現CHB患者中IL-10含量明顯升高，并且與Breg存在相關性。這說明在HBV慢性感染過程中Breg活化后能夠分泌大量IL-10參與免疫調節。CD4＋CD25＋Treg也可以分泌IL-10，在維持外周免疫耐受的過程中同樣具有重要的作用。因此，我們選擇部分CHB病例對其PBMC中CD4＋CD25＋Treg進行清除后再進行體外作用，發現Treg清除前后IL-10＋CD19＋Breg比例和IL-10含量并無明顯變化，且清除前慢性乙肝組IL-10＋CD19＋Breg比例和IL-10水平存在明顯相關性。這說明本研究中IL-10主要來源于活化的IL-10＋CD19＋Breg，同時也提示Breg的表達頻率不受Treg的影響。

最近的研究表明，分泌IL-10的B細胞可能具有誘導產生Treg的作用［8－9］。而且多項研究證實CHB患者外周血Treg比例升高。為了了解CHB中Breg與Treg之間的關系，我們通過分析各組CD4＋CD25highTreg的比例發現，CHB組Treg表達頻率高于其他兩組，且Breg與Treg的表達頻率間存在正相關。通過剔除CHB組PBMC中CD4＋CD25＋T細胞的研究發現，剔除前后Breg比例無明顯變化。該結果提示CHB中Breg對Treg可能具有調節作用，而Treg對Breg的比例則無影響。然而，我們僅僅分析了Treg的表達頻率及其與Breg之間的相關性，尚不足以證明兩者之間是否存在必然的因果關系，但是這一結果至少可以提示CHB中IL-10＋CD19＋Breg與CD4＋CD25highTreg有一定的聯系，為進一步研究兩者之間的關系提供了思路。

［1］Maini MK，Boni C，Ogg GS，et al.Direct ex vivo analysis of hepatitis B virus-specific CD8＋T cells associated with the control of infection［J］.Gastroenterology，1999，117（6）：1386－1396.

［2］Webster GJ，Reignat S，Brown D，et al.Longitudinal analysis of CD8＋T cells specific for structural and nonstructural hepatitis B virus proteins in patientswith chronic hepatitis B：implications for immunotherapy［J］.J Virol，2004，78（11）：5707－5719.

［3］Mauri C，Gray D，Mushtaq N，et al.Prevention of arthritis by interleukin 10-producing B cells［J］.J Exp Med，2003，197（4）：489－501.

［4］Mizoguchi A，Mizoguchi E，Takedatsu H，etal.Chronic intestinal inflammatory condition generates IL-10-producing regulatory B cell subset characterized by CD1d upregulation［J］.Immunity，2002，16（2）：219－230.

［5］Bouaziz JD，Le Buanec H，Saussine A，et al.IL-10 producing regulatory B cells inmice and humans：state of the art［J］.Curr Mol Med，2012，12（5）：519－527.

［6］中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會.病毒性肝炎防治方案［J］.中華肝臟病雜志，2000，8（6）：324－329.

［7］許洪林，王四清，王世峰，等.兩種CpG基序能高度活化人免疫細胞［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2001，21（5）：471－475

［8］Mauri C.Regulation of immunity and autoimmunity by B cells［J］.Curr Opin Immunol，2010，22（6）：761－767.

［9］Mauri C，Bosma A.Immune regulatory function of B cells［J］.Annu Rev Immunol，2012，30：221－241.

Expression and roles of regulatory B cells and T cells in patients w ith chronic hepatitis B

YANG Hong-lin1，2，JIN Jie1，JIANG Ting-wang3

（1.School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Departmentof Clinical Laboratory，the First People′s Hospital of Wujiang，Suzhou Jiangsu 215200；3.Institution for Laboratory Medicine of Changshu，Suzhou Jiangsu 215500，China）

Objective：To investigate the expression and roles of IL-10＋CD19＋regulatory B cells（Breg）and CD4＋CD25highregulatory T cell（Treg）in patientswith chronic hepatitis B.M ethods：A total of 28 patientswith acute hepatitis B（AHB），31 patients with chronic hepatitis B（CHB）and 25 normal subjects（HCs group）were enrolled in this study.Peripheral blood mononuclear cells（PBMC）were isolated and stimulated with CpGODN 2006 and PMA.The expression of IL-10＋CD19＋Breg and CD4＋CD25highTregwas analyzed with flow cytometry.The level of IL-10 in culture supernatantwas analyzed with ELISA.CD4＋CD25＋T cells were removed with Immunomagnetic beads to analyze the interactions between Breg and Treg.Results：After stimulation with CpG ODN 2006 and PMA，compared with the AHB group and the HCs group，percentages of Breg and Treg in the CHB group increased significantly（Breg：P＝0.003，0.001；Treg：P＜0.001，＜0.005），and no difference was found between the AHB group and the HCs group（Breg：P＝0.796；Treg：P＝0.227）.Spearman correlation analysis found that in the CHB group，Breg and Treg was positively correlated（r＝0.50，P＝0.004），but in the AHB group and the HCs group，there was no such correlation（r＝－0.15，P＝0.462；r＝0.09，P＝0.669）.IL-10 expression in the CHB group was higher than that in the AHB group and the HCs group（Z＝－6.596，－6.373，P＜0.001），and the difference between the AHB group and the HCs group was not statistically significant（Z＝－0.952，P＝0.341）.Spearman correlation analysis showed that in the CHB group，IL-10 and Bregwere positively correlated（r＝3.303，P＝0.005）.Before and after removal of CD4＋CD25＋T cells，in the CHB group，the difference between Breg and IL-10 expression was not statistically significant.Conclusion：The expression of Breg and Treg increased in patientswith chronic hepatitis B，Bregmight play a regulatory role by IL-10 secretion.

regulatory B cells；chronic hepatitis B；regulatory T cells；IL-10

R512.62

A

1671－7783（2014）01－0048－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130194

常熟市科技發展計劃（社會發展）項目（CS201113）

楊鴻林（1977—），男，福建漳州人，主管檢驗師，主要從事臨床檢驗學的研究；蔣廷旺（通訊作者），主管技師，E-mail：jtwgyp＠sina.com

2013－09－02 ［編輯］陳海林