酶催化動力學(xué)光度法測定銅(Ⅱ)

柳暢先，朱苗苗，王 藝

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

銅是人體內(nèi)的微量元素之一，但過量攝入會產(chǎn)生危害，銅對水生生物有較大影響.銅的毒性與其形態(tài)有關(guān)，游離Cu2+的毒性大于絡(luò)合銅，故Cu2+含量是食品試樣和水質(zhì)監(jiān)測的重要指標(biāo).近30年來酶反應(yīng)動力學(xué)和酶催化作用的應(yīng)用研究很活躍[1-3]，酶法可測定在酶促反應(yīng)中作為底物、輔酶、激活劑和抑制劑而存在的物質(zhì).如Chen等[4]研究了抑制劑對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的影響，用可見分光光度法和液相色譜法測定抑制劑并比較了這兩種方法；Li等[5]將醇脫氫酶固定在毛細(xì)管中，用熒光法考察輔酶的變化以測定酒精含量，檢測限1.1 g/L，變異系數(shù)為1.9%；Cheng等[6]用修飾酶電極檢測廢水中的葡萄糖，僅用不到5s的響應(yīng)時(shí)間，有良好的靈敏度和準(zhǔn)確性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

分光光度計(jì)(721型，上海第三分析儀器廠)，精密pH計(jì)(PHS-3C型，上海雷磁儀器廠)，分析天平(FA-2004型，上海精科天平廠)，磁力攪拌器(78-1型，金壇市科興儀器廠).

銅(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.0 mmol/L)：稱取0.125 g CuSO4·5H2O于燒杯中，加水溶解后定容至50 mL.尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.50 mol/L)，脲酶(0.8 U/L)，磷酸鹽緩沖溶液(0.25 mol/L, pH=6.8).納氏試劑[7]：稱取8 g氫氧化鈉溶于25 mL蒸餾水，冷卻到室溫；另稱取5 g碘化汞和3.5 g碘化鉀溶于15 mL水；將該溶液緩緩注入上述溶液中，加水至50 mL，攪拌，密塞保存.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

于Ep管中加入200 μL 0.25 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)，200 μL 1.50 mol/L尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液，一定量的銅(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液，40 μL 0.8 U/L脲酶液后混勻，反應(yīng)2 min，加入100 μL 3 mol/L硫酸溶液后混勻，移至10 mL比色管，用水稀釋至刻度，加入1 mL納氏試劑，測定425 nm處吸光度變化值(尿素水解產(chǎn)物與納氏試劑反應(yīng)生成紅色氨絡(luò)合物[7]，在425 nm處有最大吸收)，計(jì)算酶促反應(yīng)速度.

v=△A×V/(△t×ε×b)，

式中v為酶促反應(yīng)速度(酶活力，μmol/min),△A為吸光度變化值,V為比色管中溶液總體積(mL),△t為反應(yīng)時(shí)間(min)，ε為摩爾吸光系數(shù)(L/cm·mmol),b為比色皿厚度(cm).相對酶活力=(酶活力/酶活力最大值)×100%.

根據(jù)米氏方程可求出抑制劑含量：

1/v=kc+a，

式中v為酶促反應(yīng)速度(μmol/min),c為抑制劑濃度(μmol/L),k和a為常數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 測定波長的影響

在390～480 nm內(nèi)測定酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最大吸收波長為425 nm(見圖1)，若無其它雜質(zhì)吸收峰的干擾，選擇425 nm作為測定波長.

λ/nm圖1 波長對吸光度的影響Fig.1 The effect of the wavelength on the absorbance

2.2 反應(yīng)溶液pH和溫度的影響

在pH 6～8內(nèi)測定了溶液pH值的影響(見圖2a)，pH為6.8時(shí)酶促反應(yīng)速度最大，推測這時(shí)酶處于最佳的空間構(gòu)象和解離狀態(tài).溫度對酶活性有顯著影響(見圖2b)，溫度升高時(shí)，有更多的分子成為活化分子，使酶的活力增大，故酶促反應(yīng)速度增大.但溫度過高時(shí)，由于酶蛋白的熱變性致使酶逐漸喪失活力，反應(yīng)速度下降.按實(shí)驗(yàn)方法在0～80℃范圍內(nèi)測定了溫度對酶促反應(yīng)速度的影響，最適溫度為60℃.

(a) pH值；(b) 溫度圖2 反應(yīng)溶液pH和溫度對酶活力的影響Fig.2 The effect of pH and temperation of reacting solution on the enzyme activity

2.3 底物濃度的影響

測定酶促反應(yīng)中作為抑制劑存在的物質(zhì)含量，保證高靈敏度的前提是無抑制劑存在時(shí)酶促反應(yīng)速度盡可能大.考察了底物尿素濃度的影響(見圖3)，尿素濃度增加到25 mmol/L以后，酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值并基本保持不變.

圖3 尿素濃度對酶活力的影響 Fig.3 The effect of concentration of urea on the enzyme activity

2.4 共存組分的影響

試驗(yàn)了常見金屬離子K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Cd2+,Ni2+,Pb2+對測定的影響，發(fā)現(xiàn)Ca2+,Mg2+,Zn2+,Cd2+,Ni2+,Pb2+也對酶促反應(yīng)速度有抑制，但比銅(Ⅱ)的抑制作用要小得多，以0.3 μmol/L銅(Ⅱ)進(jìn)行干擾試驗(yàn)，相對誤差在±5%之內(nèi)時(shí)，共存組分允許量為：Zn2+(380倍)，Ca2+(300倍)，Mg2+(190倍)，Ni2+(190倍)，Cd2+(90倍)，Pb2+(70倍).

2.5 抑制劑標(biāo)準(zhǔn)曲線

按實(shí)驗(yàn)方法測定系列銅(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液的酶促反應(yīng)速度，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，回歸方程為：1/v= 0.716+7.66c，R=0.9986，線性范圍：0.09～20 μmol/L，檢出限為0.05μmol/L.

圖4 銅(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of Cu(Ⅱ)

2.6 試樣測定

平行5次測定了模擬樣(基體為湖水)中Cu2+含量，并進(jìn)行加標(biāo)回收，由表1可見，結(jié)果的精密度(RSD<5%)和準(zhǔn)確度(回收率在95%～105%之間)較好.

表1 試樣測定及加標(biāo)回收結(jié)果(n=5)

參 考 文 獻(xiàn)

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