度夏仿刺參病原菌伯麥羅氏弧菌的分離鑒定和特征研究

方旅平，周 宸，黃瑞芳，林 琪，何麗斌，葛 輝，李少菁*

(1.廈門大學海洋與地球學院，福建 廈門 361102；2.福建省水產研究所，福建 廈門 361013)

仿刺參[Apostichopusjaponicus(Selenka,1867)]隸屬于棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)楯手目(Aspidochirotida)仿刺參科(Stichopodidae)仿刺參屬(Apostichopus)，是我國重要的海洋養殖對象．仿刺參為溫帶種，因此仿刺參度夏是南移養殖的關鍵問題，當進入夏季后南方海域的水溫高于20 ℃時，仿刺參易于被海洋環境微生物所感染而患病，其中最常見的疾病是腐皮綜合征，如2008—2011年福建省養殖仿刺參發生腐皮綜合征，雖然未出現大規模死亡，但是這種疾病嚴重威脅著南方仿刺參養殖業持續、穩定、健康發展．

弧菌(Vibrio)在海洋環境中是普遍存在的，會以相當高的密度出現在海洋生物的體內或體表，包括珊瑚、魚類、貝類、頭足類、海綿、蝦類和浮游動物等[1-2]．目前，包括燦爛弧菌(V.splendidus)、塔斯瑪尼弧菌(V.tasmaniensis)、伯麥羅氏弧菌(V.pomeroyi)等8個在系統發生上與燦爛弧菌相近的種類被合稱為燦爛弧菌復合群(V.splendidus-like complex)[2]，此復合群中已有種類被報道會引起海洋生物發病甚至死亡[3-5]．這一復合群中的弧菌其系統發育特征較為接近，而傳統的生化實驗又耗時費力，因而如果能利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)，將為海洋水產動物病原菌的鑒定提供更為便捷、準確的鑒定方法．MALDI-TOF MS技術已在我國醫學領域內用于快速鑒定病原菌，得到了很好的結果[6]，但是在水產養殖動物的病原微生物檢測上還很少被使用，僅有零星報道[7]．本研究將運用該技術對分離自仿刺參的病原菌進行鑒定，使該技術能在水產養殖動物病原菌的鑒定領域內得到更好的推廣．

本文圍繞南移仿刺參度夏期間腐皮綜合征的病原菌的致病性、生理生化特征、16S rRNA基因序列和蛋白質譜分析等方面進行了研究，為南移養殖仿刺參的病原檢測提供了新方法，并為仿刺參南移養殖地區的病害防治奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2008和2009年的夏季福建省養殖仿刺參均發生了腐皮綜合征.2009年8月，自福建莆田的養殖池中采集患病仿刺參，同時用于人工感染的健康仿刺參也同樣采購于莆田.采集的樣品體質量為5～10 g．患病仿刺參每個個體均進行觀察并拍照．

1.2 細菌的分離與純化

選取具有典型癥狀的仿刺參，用滅菌海水清洗其體表，采用無菌操作，從患病部位(體壁)取樣約5 mm的組織塊，用無菌純水清洗數次，再用75%(體積分數)乙醇和生理鹽水依次清洗．在清洗后，將組織塊分別轉接在2216E與硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養基(TCBS)制成的瓊脂平板上，28 ℃培養48 h．觀察菌落形態，挑選優勢菌落，劃線分離、多次純化后，直至獲得純培養物后再轉接到2216E、TCBS液體培養試管內，28 ℃培養18～24 h，-80 ℃低溫冰箱保存備用．該保存菌株標記為SUS 1．

1.3 細菌回接感染實驗

將-80 ℃低溫保存的菌株進行活化，用于細菌回接感染實驗．菌株SUS 1接種于TCBS瓊脂斜面，置于恒溫生化培養箱中28 ℃培養 12 h后，用無菌生理鹽水洗脫，采用麥氏比濁法調整細菌濃度為1.0×108CFU/mL備用．

在回接感染實驗前，將健康仿刺參暫養于過濾海水中，隨機分成2組，即對照組和感染組．在感染組中，隨機選取15只健康仿刺參分為3組，每組5只，分別注射制備好的菌懸液0.2 mL．而在對照組中，則是注射0.2 mL的無菌生理鹽水．所有的仿刺參均飼養在水溫25 ℃、鹽度27,50%換水量的環境下，觀察仿刺參的發病狀況．待感染仿刺參出現腐皮病癥狀后，同上述方法挑選優勢菌落，再重復感染．將每一次回接感染后分離培養所得到的菌株分別標記為SUS 2、SUS 3，并分別對其進行鑒定．

1.4 注射感染和浸浴感染致病效果實驗

在對仿刺參進行上述回接感染的實驗時發現，其體壁組織較為特殊，注射的體積相應要降低，否則注射的菌液將有部分溢出損失．因而在注射感染實驗中，將菌株SUS 1、SUS 2與SUS 3用無菌生理鹽水制備成3.0×108CFU/mL菌懸液，用生理鹽水進行梯度稀釋至 3.0×107,3.0×106CFU/mL．將135只健康仿刺參隨機分成9組，每組15只，其中每3組仿刺參作為一個獨立實驗，分別進行菌株SUS 1、SUS 2與SUS 3的人工注射實驗．以菌株SUS 1為例，有2組分別注射0.1 mL的2個濃度梯度的SUS 1菌懸液，其余1組注射0.1 mL的無菌生理鹽水作為對照．觀察記錄仿刺參發病癥狀及死亡情況．

在浸浴實驗中，水體中的菌落終濃度分別為3.0×108和3.0×107CFU/mL．實驗仿刺參的數量和分組情況同上，并觀察記錄仿刺參發病癥狀和死亡情況．

將記錄的每日死亡仿刺參數量用Graphpad prism 軟件進行分析每日仿刺參死亡率．

1.5 細菌的生理生化指標測定

細菌的生理生化試驗按《伯杰氏細菌鑒定手冊》[8]和《常見細菌系統鑒定手冊》[9]方法進行．本研究中主要采用了API 20E和API 半自動化鑒定方法．

1.6 細菌的質譜分析方法

首次分離得到的菌株SUS 1以及人工回接感染后分離培養的SUS 2、SUS 3，分別用MALDI-TOF MS方法進行鑒定．具體操作方法如下：挑取菌落，純化培養后，接種肉湯，37 ℃培養18～24 h．取1.5 mL培養液于離心管中，10 000 r/min離心1 min，棄上清，生理鹽水洗滌2遍，棄上清．加入300 μL超純水，混勻，再加入900 μL無水乙醇，混勻．高速離心2 min，棄去上清(必要時，再離心一次，盡量去除乙醇)．加入50 μL 70%(體積分數)甲酸和50 μL乙腈，混勻，高速離心2 min，吸取上清液點樣．

將樣品板置于板孔中，加有樣品一面朝上，蓋上蓋子，抽真空．打開儀器控制軟件FlexControl調好儀器參數，校準儀器．手動采集標準品及樣品的質譜圖，以線性正性模式用最大頻率采集．每個樣品重復4次以上．譜圖也可以自動獲取，用autoExecute軟件使用激光強度的模糊控制來進行．

采集細菌的質譜數據后利用分析軟件Biotyper，選擇細菌數據庫，調入并選中樣品數據．選擇菜單命令Identification/start identification進行鑒定；選擇菜單命令Report/show report顯示鑒定報告；選擇菜單命令File/save as把報告存到文件目錄．

1.7 細菌16S rRNA基因片段序列分析

取10 μL過夜培養的菌液，置于PCR反應管中，離心，去除培養基，加10 μL 滅菌超純水于99 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min，上清即為細菌DNA，可作為PCR模板．

本研究中細菌16S rRNA基因的PCR擴增，是采用該基因的一對通用性引物，具體引物序列如下：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)．PCR擴增體系：5 μL 10×PCR緩沖液，200 mmol/L dNTPs,0.4 mmol/L引物，1.25 U ExTaq polymerase聚合酶 (TaKaRa Biotechnology Co.，大連)，1 μL細菌DNA．PCR擴增程序如下：94 ℃變性 5 min，30個循環(94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min)，72 ℃延伸10 min．PCR產物經1.5%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至南京金斯瑞生物公司測序．

測序獲得的核酸序列利用BLAST在GenBank中比對相近序列，用MEGA 4.0軟件Neighbour-Joining方法構建系統進化樹(bootstrap=1 000)．

2 結 果

2.1 細菌的回接感染實驗結果

分離菌人工感染后，實驗組出現表皮潰爛癥狀，而對照組無任何癥狀．在感染早期階段，被感染的個體表現出虛弱、進食減少、回轉擺動等癥狀．之后其體壁顏色變得灰暗，逐漸褪色，并分泌大量的黏液．表皮開始出現白色小點，逐漸擴大，深入內層并相互合并．人工回接感染實驗后，仿刺參均出現與自然發病相同的癥狀(圖1)．因而，該結果可以確定本次實驗分離出的細菌是導致度夏刺參腐皮綜合征的病原菌．

2.2 仿刺參注射感染和浸浴感染實驗結果比較

進行注射感染和浸浴感染實驗后，仿刺參每日死亡率如圖2和3所示．仿刺參在人工注射感染和浸浴感染實驗中均出現了腐皮綜合征癥狀，并隨著時間推移出現死亡．其中，人工注射感染組均在第2天就出現死亡個體，有4組仿刺參在第7天死亡率就達到了100%．在浸浴感染組中，仿刺參直至第4天才出現死亡個體，僅有1組仿刺參在第7天死亡率達到100%．

2.3 菌株生理生化指標的測定結果

病原菌在TCBS培養基上，28 ℃培養48 h，形成黃色、半透明、凸起的具有光滑邊緣的直徑4 mm的圓形單菌落．菌落能在35 ℃生長，4 ℃和40 ℃不生長．生化特征為革蘭氏陰性；β-半乳糖苷酶(Beta-galactosidase)陽性；尿素酶(urease)、精氨酸雙水解酶(arginine dihydrolase)、賴氨酸脫羧酶(lysine decarboxylase)和鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase)等陰性．該菌株發酵蔗糖(sucrose)和甘露醇(mannitol)，但不發酵阿拉伯糖(arabinose)、肌醇(inositol)、鼠李糖(rhamnose)或山梨糖(sorbitol)．下列化合物能被其利用：纖維二糖(cellobiose)、N-乙酰-D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)、麥芽糖(maltose)、乳酸(lactic acid)、L-天冬氨酸(L-aspartic acid)．沒有一個菌株能利用：丙酸(propionic acid)，枸櫞酸鹽(citrate)，側金盞花醇(adonitol)，M-肌醇(m-inositol)，檸檬酸(citric acid)或癸二酸(sebacic acid)．其他指標見表1．

(a)、(b)：度夏過程中自然發病的仿刺參；(c):1.對照組(健康)仿刺參個體,2.人工回接感染組仿刺參個體，感染白點已經擴大(A部位), 3.人工回接感染組仿刺參個體，體表出現小白點(B部位),4.人工回接感染組仿刺參個體，潰爛部位互相融合(C部位).圖1 仿刺參人工回接感染后的觀察Fig.1 Observation of sea cucumber A. japonicus after recursive infection

圖2 仿刺參人工注射V. pomeroyi SUS感染的實驗結果Fig.2 The results of artificial injection test with strain V. pomeroyi SUS to A. japonicus

圖3 仿刺參V. pomeroyi SUS浸浴感染的實驗結果Fig.3 The results of immersiontest with strain V. pomeroyi SUS to A. japonicus

2.4 菌株的質譜鑒定結果

2010年進行人工回接感染實驗中，菌株SUS 1、SUS 2和SUS 3的飛行質譜測定結果見圖4的(b)、(c)、(d)，其MPS值(MALDI Spectrum Match Scores)均為2.034(見表2)，MPS值均大于2.000．在該鑒定系統中，當MPS值處于范圍2.000～3.000時，該系統鑒定結果能確認到種(species identification)，使用綠色標記；當值處于1.700～1.999時，該系統能確認到屬(genus identification)，使用黃色標記；當值處于0.000～1.699 時，則系統無可靠的鑒定結果(not reliable identification)，使用紅色標記．本次實驗中，根據質譜結果匹配的菌株是V.pomeroyiDSM 17180 HAM，因此，本次實驗分離純化的病原菌鑒定為伯麥羅氏弧菌，本課題組將菌株命名為V.pomeroyiSUS．

其中，值得一提的是菌株SUS 1在2009年12月被分離純化培養后第一次被測定，其質譜測定結果見圖4(a),之后保存于-80 ℃直至2010年9月被再次測定．質譜的測定分析的MPS值分別為2.086和2.034，雖然數值不同，但鑒定結果均為伯麥羅氏弧菌．

2.5 病原菌基因序列測定及系統發生樹的構建

本研究測定了病原菌菌株SUS 1～SUS 3的16S rRNA基因片段序列，序列長度分別為1 425，1 357，1 357 bp，已經提交GenBank數據庫(登錄號：KF743852、KF743853、KF743854)．綜合生理生化特征研究結果和質譜鑒定結果，從GenBank數據庫中選取以下序列以構建系統發生樹：典型菌株V.pomeroyiLMG 20537T和非典型菌株V.pomeroyiDHQ2，典型菌株V.gigantisLGP 13，典型菌株V.chagasiiLMG 21353，典型菌株V.splendidusATCC 33125T和非典型菌株V.splendidusLMG 10952．使用DNAMAN軟件5.0編輯序列，將序列長度統一截取為1 204 bp，利用軟件MEGA 4.0構建系統發育樹(圖5)，其中霍亂弧菌(V.choleraestain ATCC 14035T)作為外群(outgroup)．同時，DNAMAN 5.0也計算得出SUS 1～SUS 3的16S rRNA基因片段序列與典型菌株V.pomeroyiLMG 20537T的序列相似度分別為98.9%、98.9%和98.8%．

系統發育分析表明，3株菌株(SUS 1～3)是同一種，屬于燦爛弧菌復合群．該病原菌與V.pomeroyiDHQ2的關系最近，而與典型菌株V.pomeroyiLMG 20537T在系統發生樹中并沒有最先歸為一支．

綜合3種研究方法的鑒定結果，本實驗分離獲得的度夏仿刺參腐皮綜合征的病原菌為V.pomeroyiSUS．

3 討 論

3.1 細菌鑒定方法的比較

海洋細菌鑒定曾長期困擾著研究人員．然而，隨著新技術的發展，鑒定物種已變得更為迅速及準確，例如目前分子生物學技術被日益廣泛地應用于鑒別細菌種類的熒光素標記選擇性擴增片段長度多態性(FAFLP)、DNA-DNA雜交、基因測序等．在細菌和古細菌的線粒體和葉綠體中，核糖體小亞基包含16S rRNA基因．隨著時間的推移，其功能沒有改變，并且攜帶足夠多的生物信息，因此，16S rRNA基因可用于物種分類和系統發育的研究[10]．當細菌或古細菌的不同物種間具有相當高的保守性時，還可以通過該基因評估物種分化的速率[11]．

表1 伯麥羅氏弧菌各菌株間的表型特征變化比較Tab.1 Variable phenotypic features among strains of V. pomeroyi

注：1～4分別為伯麥羅氏弧菌的不同菌株，具體為:1.V.pomeroyiSUS 1 (菌落1)；2.V.pomeroyiSUS 2 (菌落2)； 3.V.pomeroyi(n=6)(含V.pomeroyiLMG 20537T)(Thompson等,2003)；4.V.pomeroyi929(Beleneva等,2010).

+.陽性；—.陰性；ND.無數據；v.變化；type strain.典型菌株.

但是，我們認為16S rRNA基因序列用于鑒定物種，雖是一種可行的方法，卻受限于其有限的數據庫序列信息．例如基因數據庫提交的序列大多是非完整的基因序列，序列片段的信息量較少；在提交序列時，并無相關物種符合性的審核，僅是一個共享數據庫．所以在進行序列比對時往往可能出現結果偏差．此外，16S rRNA基因序列在弧菌屬內保守性很高，特別是被鑒定的菌種屬于一個復合群時，其序列更為相似，在鑒定這些種類時僅利用16S rRNA的部分基因序列其準確度往往受到質疑，更難以準確地甄別．本文中的系統發生樹(圖5)可以看出，由于燦爛弧菌復合群中的種類在系統發生上具有很高的相似性，作為燦爛弧菌復合群中的同一種細菌的不同菌株，例如：燦爛弧菌、伯麥羅氏弧菌，若僅利用16S rRNA的部分基因序列與該復合群的其他種類進行系統發生分析時，2個同種的菌株并非在最接近的位置．因此，測序結果分析僅能表明本研究分離獲得的病原菌與V.pomeroyiDHQ2的親緣關系最為接近．

(a)菌株SUS 1分離純化后的質譜測定結果;(b)菌株SUS 1冷凍保存活化后的質譜測定結果; (c)菌株SUS 2的質譜測定結果;(d)菌株SUS 3的質譜測定結果.圖4 伯麥羅氏弧菌質譜測定結果Fig.4 Mass spectrometric profiles of V. pomeroyi

菌株預備程序測試時間鑒定種類MPS值SUS 1LBglc2009-12-18V. pomeroyi DSM 17180 HAM2.086SUS 1LBglc2010-09-30V. pomeroyi DSM 17180 HAM2.034SUS 2LBglc2010-09-30V. pomeroyi DSM 17180 HAM2.034SUS 3LBglc2010-09-30V. pomeroyi DSM 17180 HAM2.034

圖5 基于16S rRNA基因序列的菌株SUS 1～3的系統發生樹Fig.5 Neighbor-joining phylogenetic tree of strains SUS 1-3 based on partial 16S rRNA sequences

為了能快捷準確地鑒定病原菌，除了運用16S rRNA基因序列測序分析以外，引入MALDI-TOF MS技術進行鑒定，同時在進行鑒定分析時結合了微生物數據庫MALDI Biotyper系統．以往利用MALDI-TOF MS技術鑒定微生物，大部分都集中在臨床醫學領域或食品檢測領域，Cherkaou等[12]與曾白華等[13]正是在對臨床微生物的MALDI-TOF MS技術運用的研究中指出傳統的鑒定方法費時費力，操作復雜，而MALDI-TOF MS質譜技術將比傳統的表型特征鑒定方法更為經濟和快捷，在準確度上與傳統方法等同甚至更為準確．該技術的另一重要優勢是，其對細菌鑒定的高度可重復性是基于某些高豐度蛋白的測定，其中包括許多核糖體蛋白，因為核糖體蛋白是細胞轉化機制的一部分，它們存在于所有的活細胞中，因而質譜蛋白指紋技術幾乎不受生長和環境條件變化的影響[14]．在本研究中，菌株SUS 1前后測定了2次，第1次為2009年通過分離純化獲得的菌落，第2次是經過-80 ℃保存約9個月后重新活化后的菌落．2次測定獲得的數據結果通過軟件BioTyper 2.0分析其值分別為2.086和2.034，雖然數值略有差異，但軟件給出的鑒定結果均為V.pomeroyiDSM 17180，該菌株為伯麥羅氏弧菌的典型菌株．此外，菌株SUS 1冷凍保存活化后用于人工回接感染，每次感染后重新分離培養獲得的SUS 2、SUS 3菌株在進行質譜分析時，其測定值均為2.034．可見，該技術在鑒定細菌時具有很好的重復性，這與其他研究人員[15-17]得出結論相同，針對非發酵型細菌，以MALDI-TOF MS質譜技術為基礎的鑒定方法為細菌鑒定提供了準確、重復性良好的結果．

總之，MALDI-TOF MS質譜技術結合Biotyper微生物數據庫系統的鑒定方法是一種鑒定海洋水產養殖動物致病菌的準確、快速、重復性高的方法．

3.2 伯麥羅氏弧菌的致病性

仿刺參誘導腐皮病發病的相關微生物已有研究，例如，已有報告指出多種屬于γ-變形菌亞門(γ-protebacteria，theAlteromonadalesandVibrionalesgroups)的菌株，是引起仿刺參腐皮病發病的主要細菌類群[18]．此外，從仿刺參潰爛皮膚和腫大口緣組織處分離的菌株已被確定為一種假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)和河豚毒素假交替單胞菌(P.tetraodonis)[19]．但國內大部分仿刺參疾病的研究對象是北方養殖仿刺參群體，本文著重研究仿刺參在南方度夏期間發生腐皮綜合征的病原菌．實驗中，從患病仿刺參上分離的伯麥羅氏弧菌感染健康仿刺參后，觀察到了與自然發生的疾病中同樣的癥狀．從人工感染發病的仿刺參上再次分離到該菌株，并再次驗證，這符合了病原微生物確認的科赫法則．同時，人工感染實驗采用了注射和浸泡2種方式，實驗結果表明機械性皮膚損傷并不是發病所必需的條件，浸泡感染實驗中，仿刺參同樣也會發病．當然，與浸泡感染相比，注射感染更容易發病．

該菌在以往的仿刺參腐皮病綜合癥病原菌的研究中未被報道，并且在以往國內外學者對伯麥羅氏弧菌的研究中，伯麥羅氏弧菌未被發現是誘導水生生物發病的病原體，僅僅作為一種分布在海洋環境中或生存于海洋生物體內的微生物被報道．2003年Thompson等[20]首次在巴西南部的一種扇貝Nodipectennodosus的健康幼蟲中分離獲得伯麥羅氏弧菌．此外，在日本沿海魚類腸道中也發現這種細菌[21]．來自于Hell Vent的一種蠕蟲伯麥氏弧菌(Paralvinellasulfincola)中分離的菌株與從Nodipectennodosus幼蟲分離獲得的伯麥氏弧菌的相似性高達99.8%[22]．伯麥羅氏弧菌也曾被報道從光棘球海膽(Strongylocentrotusnudus)的腸道內含物中被分離獲得[23]．國內對伯麥羅氏弧菌的相關研究極少，陳君[24]在研究來自于半滑舌鰨的病原菌時，獲得一株優勢菌未能確定菌種，在系統發育樹中疑似伯麥羅氏弧菌，并指出它的致病性仍然未知．黨法斌等[25]在利用幾種海藻多酚對魚類致病菌的抑菌性研究中，將海洋弧菌屬中的海神弧菌(V.brasiliensis)、巴西弧菌、徐氏弧菌(V.xuii)、查格斯氏弧菌(V.chagasii)、鰻弧菌(V.anguillarum)、伯麥羅氏弧菌及哈維氏弧菌(V.harveyi)作為實驗對象進行了生長的抑制性實驗，這其中并未指明伯麥羅氏弧菌能導致的魚類疾病．

因此，本研究結果不僅確認了伯麥羅氏弧菌對海洋生物的致病性，而且對南移仿刺參疾病的檢測和預防累積了相關的資料．

3.3 伯麥羅氏弧菌不同菌株的特征比較

V.pomeroyiLMG 20537T[20]來自巴西南部，V.pomeroyi929[23]采集自日本海，這2個菌株作為本研究獲得V.pomeroyiSUS菌株表型比較分析的對象．通過對比，V.pomeroyiSUS菌株的生理特性與V.pomeroyiLMG20537T及V.pomeroyi929基本一致．不同的是，本研究中的V.pomeroyiSUS可在35 ℃下生長，但無法在4 ℃下生長；此外與典型菌株不同的，V.pomeroyiSUS和V.pomeroyi929均無法在含8%(質量分數)NaCl的培養基上生長．而在已有的研究報道中，細菌的生態相關特征被認為可能會反映出海洋環境對菌株的影響[23]．

本研究是在夏季分離純化獲得菌株V.pomeroyiSUS，采樣地點位于福建莆田平海．根據已有的文獻報道莆田平海仿刺參南移養殖區域的海水水溫變化范圍為13.7～32.7 ℃[26]．可以看出，福建莆田的海水溫度在夏季達到30 ℃以上，有時高達32.7 ℃．而伯麥羅氏弧菌的典型菌株V.pomeroyiLMG 20537T分離自來源于巴西南部的圣卡塔琳娜州(Santa Catarina)的首府弗洛里亞諾波利斯(Florianópolis)的Nodipectennodosus的健康幼體．該海域具有優良的海水條件，建立了許多貝類養殖場，弧菌是該區域海水中細菌的優勢類群．Rupp等[27]在研究圣卡塔琳娜州沿岸的Nodipectennodosus幼體深度和放養密度對其生長的影響時提到該海域受到南大西洋中央水(south atlantic central water，SACW)的影響，該洋流水溫低，即使在夏季，由于溫暖的巴西流的緣故，該海域表層水溫較高，但最高為28 ℃[28]，而在受到SACW影響的水域溫度甚至能低于20 ℃[27]．另一菌株V.pomeroyi929采集自彼得大帝灣(Peter the Great Bay)，該海灣是日本海最大的海灣，處于西北太平洋邊緣[29]．在冬季，沿岸水溫下降至-1或-2 ℃，開放海區水溫會稍高一些；在夏季，海灣表層水溫較高，但在8月內灣的表層水溫最高也僅能達24～26 ℃[29]．可以看出，莆田平海仿刺參南移養殖區域的水溫比后兩者表層水溫高得多，因而，本研究分離所得的菌株V.pomeroyiSUS對高溫的適應性更好，能在35 ℃培養條件下生長，而另兩地分離的菌株無法在此溫度條件下培養，卻能在較低的溫度，如4 ℃下生長．

對鹽度這個生態因子來說，莆田平海仿刺參南移養殖區域的鹽度為30.40～31.65[26]，鹽度相對穩定，鹽度最高也未超過32．彼得大帝灣分離的菌株V.pomeroyi929處所該海灣的開放區表層鹽度介于32至33，但是由于徑流的影響，在內灣靠近河口的區域鹽度將會下降10%～20%或者降水量大時下降較多[21]，因而該菌株相比而言對低鹽度的耐受性較強．三地中，圣卡塔琳娜州扇貝養殖區所處海域受到南大西洋中央水(SACW)的影響，該洋流鹽度較高，約為35，并且即使在12 m深處，一年的大部分季節其鹽度仍然保持在將近33[27]．分析這3株菌株所處的海域環境的鹽度特征后發現，3株菌株的相關生態特性與海域鹽度因子間存在一定的聯系，來自于巴西圣卡塔琳娜州鹽度較高海域的的典型菌株V.pomeroyiLMG 20537T能在含8%(質量分數)NaCl培養基上生長，而2株采集自鹽度相對較低海域的菌株則無法在含8%NaCl培養基上存活．

分析本研究獲得的菌株V.pomeroyiSUS的生理生化的實驗數據，表明該菌株具有適應較高溫度和較低鹽度環境的特點．同樣，LMG 20537T和929菌株也分別表現出適應其生長環境的生態特征．此外，V.pomeroyiSUS和V.pomeroyiDSM 17180 HAM菌株通過MALDI Biotyper系統比較分析匹配值僅略大于2，這反映2個菌株之間存有一定差異．同樣地，16S rRNA基因測序分析的結果也反映了來自不同地區的菌株的多樣性．因此，本研究分離純化的V.pomeroyiSUS和其他菌株之間的確具有某些差異，不論是在生理生化特征上，還是在遺傳特征和蛋白指紋圖譜方面均有自己的特征．然而，這些差異目前是否已經達到變異亞種水平，還需要進一步研究．

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