日本囊對蝦精莢再生能力的研究

林 莉,姚東明,林瓊武,李 飛

(廈門大學海洋與地球學院,福建 廈門 361102)

從20世紀70年代至今,我國的對蝦養殖業在經歷了諸多磨難之后,已經發展為漁業經濟的支柱產業．日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)不僅具有個大、體色鮮艷悅目和肉質口感好等特點,同時還具有離水性好,適合活蝦運輸和市場價格高的優勢,而且,與凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、斑節對蝦(Penaeusmonodon)和中國明對蝦(Fennerpenaeuschinensis)在生態習性上有著很強的互補性．因此,日本囊對蝦在我國對蝦養殖業扮演著越來越重要的角色．

目前,在對蝦繁殖生產方面,業者至今習慣沿用從自然海區捕獲的已交配的成熟雌蝦,而在對蝦生殖生物學研究方面,學者的興趣也主要集中在雌蝦的生殖系統及卵的發育[1-6],而對雄蝦相關的研究僅在雄蝦生殖系統的結構、促雄腺的結構、作用及精子的形態、發生[7-10],輸精管內精莢的超微結構和形成[11-13],有關雄蝦精莢再生的研究只見一些零星的報道[14-16],迄今日本囊對蝦在精莢人工移植、經產雌蝦再交配技術上尚未突破,因而有關精莢再生的研究更是難得一見,這也是日本囊對蝦養殖業的規模化、產業化遠不及凡納濱對蝦和斑節對蝦主要原因[2,16]．因此,開展日本囊對蝦精莢再生能力和再生精莢質量的研究勢在必行．本文主要報道了日本囊對蝦精莢的若干重要參數、再生次數、再生時間間隔、再生精莢質量差異以及具有不同精莢再生能力的個體在親蝦群體中比例分布的實驗結果,以期為對蝦繁殖生物學和遺傳育種學提供理論資料,為日本囊對蝦雄親蝦資源的利用和保護提供科學依據．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗在漳州漳浦宏運水產育苗場進行．成熟雄蝦捕自臺灣海峽自然海區,采用低溫木屑無水包裝法將親蝦運至實驗場;雌蝦是經育苗場生產使用過的親蝦,處于即將脫殼或已蛻殼,購自漳浦大尾魚水產育苗場,采用蝦苗袋充氧且低溫(14～16 ℃)運輸至實驗場．

雌、雄親蝦分開馴養．入池前經緩慢升溫復蘇,再經高錳酸鉀溶液(質量濃度為30 g/m3)消毒處理,移入帶有海沙底的水泥池內(水溫17～19 ℃,鹽度30～32,pH值7.8～8.3)進行喂養,養殖池長寬規格為423 cm×138 cm,水深(40±5) cm,全程充氣．雄親蝦在實驗之前需在適宜的條件下暫養3～5 d．池內不間斷通氣,每天進行1次換水(日換水量為總水量的1/3～1/2)并使用虹吸管吸出殘餌和糞便,每日投餌次數為2次,分別為早上10:00和晚上19:00,早上投喂很少,晚上投喂量較多,日投餌量為親蝦體質量的10%～20%,視攝食情況酌情增減,餌料為新鮮雜色蛤仔(Ruditapesvariegata)和近江牡蠣(OstrearivularisGould)．控制好光線、培育密度等．觀測到雌蝦即將產卵,將其移入促熟池[2]．

1.2 實驗方法

表1 日本囊對蝦的體長、體質量及精莢若干參數(n=72)Tab.1 Body length、body weight and main parameters of spermatophore in Marsupenaeus japonicus(n=72)

1.2.1 親蝦個體標記

將硬紙板剪成的圓形小片作為編號牌,用小刀刻上編號．制作時注意修整紙板邊緣,避免留下易對親蝦造成傷害的刺突．然后用尼龍繩將編號牌系在親蝦眼柄基部,作為個體標記,方便實驗中追蹤每尾雄蝦各自不同的精莢再生情況,同時在研究再生精莢質量時,用此法對比個體內不同批次的精莢質量,從而消除不同雄蝦個體之間的差異,使結論更能反映不同批次精莢的真實情況．

1.2.2 精莢的采集

精莢的采集是以袁路等[15]和李飛[16]的人工擠壓法和洪心等[17]的夾取法為基礎,將2種方法結合,即人工擠壓-夾取法,輕壓雄蝦第五步足基節的基部,然后用消毒鑷子取出精莢．采集完成后,把雄蝦放回暫養池,觀察其復蘇狀況,避免其出現側臥現象．

1.2.3 體外人工授精

采用濕法授精,即從性成熟的雌蝦中取出卵巢,并剪開精莢,同時將兩者在裝有過濾海水的培養皿中輕輕抖動,使精子、卵子于海水中充分混合,30 min后,用注射器吸棄海水,再注入新鮮過濾海水,重復換水3次后,吸取適量卵子于顯微鏡下統計受精率．

1.2.4 精子活體染色

將精莢剪碎,讓精莢內精子充分釋放,加入1 000 mL海水進行稀釋,制成精子懸液．用伊紅苯胺黑染色法進行染色,取5 μL精子懸浮液于載玻片中央,再滴加5 μL 0.5%(質量分數)伊紅染液和5 μL 10%(質量分數)苯胺黑染液,使三者混合均勻,染色3 min,蓋上蓋玻片,在400×的顯微鏡下檢驗．在顯微鏡下,活精細胞不被著色,死精細胞被染成紅色,而畸形精細胞則呈非圓球狀．

1.2.5 精莢再生的觀測

以海捕雄蝦原有精莢為初始精莢,在每次獲取精莢后,每天觀察手術后雄蝦精莢再生情況及不同雄蝦在人工獲取精莢條件下,精莢能夠再生的批次數,記錄下不同批次精莢再成熟的時間．同時,采用擠壓-夾取法獲取再生精莢,測定其精子合格率、精子數、受精能力．建立親蝦個體檔案．實驗親蝦共72尾,其中9尾親蝦無法完成精莢再生,63尾親蝦精莢可再生1次,表示為第1批再生精莢,記為F；58尾親蝦精莢可再生2次,表示為第2批再生精莢記為S；32尾親蝦精莢可再生3次,表示為第3批再生精莢記為T.

1.2.6 精莢若干參數的說明

精莢質量:用擠壓-夾取法獲取新鮮精莢,以最小稱量單位為0.01 g的電子天平稱量每個精莢的質量．

精子總數:將每個精莢放入玻璃研缽中,并加入2 mL的生理鹽水,移液槍吸取200 μL到5 mL的離心管中,再加入2 800 μL生理鹽水,然后按照上述過程再稀釋1次．之后,用滴管吸取一定量的精子懸浮液,滴到計數板上,用常規細胞計數法計算精子數量．

精子數(25格×16格)=80小格內細胞個數/8×400×10 000×稀釋倍數×2.

精子合格率=1-(死亡精子+畸形精子)/精子總數．

受精能力:采用濕法授精,以卵子的受精率作為衡量精莢的精子授精能力的指標．

1.2.7 數據處理

實驗數據用SPSS和Excel分析處理,數據結果用“平均值±標準誤差”的形式表示．

2 結 果

2.1 日本囊對蝦精莢的主要參數及其相關性分析

海捕雄蝦經暫養,精莢首次成熟后所測的主要參數見表1,其中體質量和精莢質量的變異系數都比較大．體質量、體長與精莢質量的關系見圖1和2．

圖1 精莢質量與蝦體質量關系Fig.1 The correlation between spermatophore weight and body weight

圖2 精莢質量與體長關系Fig.2 The correlation between spermatophore weight and body length

根據雙變量相關性分析結果,體長、體質量、精莢質量三者之間存在著顯著的正相關關系(p<0.01)．精子合格率、受精能力、精子總數與其他變量之間的相關性都不高(p>0.05)．

2.2 日本囊對蝦精莢再生的次數和時間間隔

2.2.1 日本囊對蝦親蝦群體中不同精莢再生能力的個體占群體總數的比例分析

具有不同精莢再生能力的個體在親蝦群體中的比例分布見圖3．由圖可知,雄親蝦群體再生能力的不同個體比例在44.44%～87.50%內,且雄親蝦在一個蛻殼周期內精莢可再生1～3次,平均為2次．

圖3 日本囊對蝦親蝦群體中具不同精莢再生能力的個體占總數的比例Fig.3 The proportion of individuals with various regeneration ability in the population of male broodstock M. japonicus during spermatophore regeneration

2.2.2 日本囊對蝦精莢再生的時間間隔及其差異分析

日本囊對蝦雄親蝦第2批及第3批再生精莢每次再生的時間見表2．

表2 不同批次精莢每次再生的時間Tab.2 Duration of different batches of spermatophore regeneration

對表2數據進行線性相關分析,可知無論是第2批精莢還是第3批精莢,它們前后2次再生時間均無顯著的線性相關關系．同時,第1次再生時間與第2次再生時間間隔不存在顯著差異(p>0.05);第2次再生時間與第3次再生時間間隔也不存在顯著差異(p>0.05)．

可以初步判斷,精莢再生的時間間隔為5～7 d,隨精莢再生次數的遞增間隔的時間有延長的態勢,但差異不明顯(p>0.05)．

2.3 日本囊對蝦不同批次再生精莢質量的比較

以精莢質量、精子總數、精子合格率及受精能力作為評判不同批次再生精莢質量參數,結果見表3,其中實驗親蝦共72尾,9尾無法完成精莢再生．

由結果可知,在第1批次再生精莢中初始精莢在精莢質量、精子總數、受精率上都極顯著地大于第1次再生精莢(p<0.01)．而初始精莢的精子合格率顯著高于第1次再生精莢(p<0.05)．

在第2批次再生精莢中第1次再生精莢精子總數少于第2次再生精莢,精子合格率、受精率高于第2次再生精莢．且第1次再生精莢與第2次再生精莢,在精子總數、精子合格率、受精率上都存在有極顯著差異(p<0.01)．第1次再生精莢質量顯著高于第2次再生精莢質量(p<0.05)．

在第3批次再生精莢中第2次再生精莢精子總數大于第3次再生精莢,但二者無顯著差異(p>0.05),第2次再生精莢的精子合格率、受精率都極顯著高于第3次再生精莢(p<0.01)．第2次再生精莢質量顯著大于第3次再生精莢質量(p<0.05)．

表3 不同批次再生精莢質量的差異Tab.3 The differences of spermatophore quality between different regeneration batches

注：Fn0、Fn1表示第1批再生中初始精莢、第1次再生精莢;Sn1、Sn2表示第2批再生中第1次、第2次再生精莢;Tn2、

Tn3表示第3批再生中第2次、第3次再生精莢.

因此,精莢的質量、精子合格率和受精能力隨再生次數增多呈下降趨勢,差異顯著(p<0.05)．而精子總數在不同批次隨再生次數增多總體呈上升趨勢,差異顯著(p<0.05);但在同一批次的再生精莢中精子總數呈現上下起伏波動,即在第1批次與第3批次中精子總數隨再生次數增加均下降,在第2批次中精子總數隨再生次數增加明顯上升(p<0.01)．

3 討 論

3.1 不同獲取精莢的方法對雄蝦精莢再生的影響

精莢獲取方式對雄蝦精莢再生的影響如何,已引起許多學者的關注．洪心[17]分別對斑節對蝦和長毛明對蝦(P.penicillatus)的雄親蝦采用擠壓法獲取精莢,發現斑節對蝦殼厚,不易獲得精莢,還會因操作不當導致雄親蝦受傷死亡;而長毛明對蝦殼薄,雖可獲得精莢,但往往因擠壓時力度掌握不當,引起雄親蝦損傷,甚至死亡．另外,對2種雄親蝦采用虹吸法獲取精莢發現均無法吸出完整的精莢．張偉權等[18]應用高頻電針法對凡納濱對蝦獲取精莢,發現用此方法獲取精莢的成功率及獲取精莢后雄蝦的存活率均為100%,且取得的精莢內精子無需“獲能”即可使卵子授精．李飛[16]通過對比夾取法和電刺激法對日本囊對蝦精莢再生的影響,發現夾取法獲取多批次雄蝦精莢后,精莢質量快速下降;而電刺激法獲取的精莢質量相對較為穩定．在本實驗中采用擠壓-夾取法人工獲取再生精莢,發現在前2次人工獲取精莢后,雄蝦存活情況較為穩定,死亡率不超過15%,但第3次人工獲取后,死亡率上升,至第4次人工獲取后,雄蝦全部死亡;且伴隨再生批次增加,對蝦再生精莢質量呈下降趨勢,與前面研究相符合．Pratoomchart[19]和Rosas等[20]也報道其他種類在實驗室條件下,再生精莢精子數量和質量下降的研究結果．

可以認為電刺激法對雄蝦傷害較小,精莢再生率高,獲取的精莢質量相對較為穩定;而夾取法對雄蝦傷害較大,機體的應激反應較強,精莢的再生率和個體存活率逐漸降低,所獲取的多批次精莢的質量快速下降．因此,本實驗采用擠壓-夾取法獲取精莢較電刺激法在效果上有所欠缺,但此法操作簡便易行,且整個實驗過程,盡可能地減少親體的損傷和死亡,獲得了完整、健康的實驗精莢,達到了預期的實驗結果．且在選用養殖日本囊對蝦雄蝦精莢進行人工受精時,應當挑選再生批次較少的雄蝦(即挑選精莢可再生1～2次的雄蝦)獲取精莢．

3.2 對蝦親蝦性腺再成熟能力的個體差異

雌親蝦性腺再成熟能力的個體差異問題已有很多報道[21-23]．林瓊武等[3]探討了日本囊對蝦再交配、親蝦多次產卵及其卵子質量的關系,實驗結果表明日本囊對蝦親蝦多次產卵的卵徑、孵化率和無節幼體不受產卵次數的影響,而卵徑和無節幼體體長與再交配親蝦個體大小關系不明顯．雄蝦的精子合格率、受精能力反映的是精子質量的指標,與前者相互對應,本實驗結果表明其均與親體大小無關．袁路等[15]在對凡納濱對蝦的研究中也發現,個體大小接近的凡納濱對蝦精莢質量與精子質量沒有顯著相關關系,雄蝦的精子數量與個體大小無關,同樣與本文結果相一致．

在本實驗中個體大小相近的對蝦的精莢質量和精子數量沒有相關關系,這是因為精莢由精子團、精莢基質和精莢壁3部分組成,并不由精子團單一決定[24],因此,質量大的精莢精子數量不一定就多．對于甲殼動物十足類精莢,每個精莢內所含有的精子數差異很大,一般范圍在幾個至幾百個不等,多的會達到上千個[13]．這表明精子是在精莢形成的過程中被隨機包被的．本研究還表明了精子數量與體長、體質量和精子合格率均無顯著相關性．

因此,個體大小與精莢質量并不具有顯著的相關性,以個體大小作為選擇優質日本囊對蝦精莢的考量標準,可靠性不足．對于日本囊對蝦精莢質量評價的間接指標,有待進一步探索．

3.3 對蝦再生精莢的質量問題

影響對蝦再生精莢的因素有很多．王清印等[14]、楊叢海等[25])研究了雌雄性比對中國明對蝦精莢再生的影響,認為充足數量雌對蝦的存在對于雄蝦精莢的再生和發揮雄對蝦的交配能力可能有促進和誘導作用．袁路等[15]研究了溫度、鹽度對凡納濱對蝦精莢再生和精子質量的影響,認為溫度與精莢質量有一定的相關關系,溫度低,精莢較重．溫度在26 ℃時,對蝦精子質量最好,溫度越高,蛻皮周期越短,精莢再生時間也越短,但精子質量下降也很迅速．鹽度為15條件下精子發育良好．隨著實驗養殖時間的延長和精莢再生次數的增加,對蝦的精子質量總體呈下降趨勢,尤其在高溫和低鹽條件下易導致精子畸形．然而,再生批次的增加伴隨著再生精莢質量下降,二者的聯系,在不同的蝦種間,可能存在差異．斑節對蝦第1次與第2次(間隔15 d)獲取的精莢,在精莢的質量、精子的數量,以及畸形精子百分率上沒有差異,這就表明連續獲取精莢對精莢質量不會有影響[26]．Gomes等[27]也曾連續6個星期觀察到,從斑節對蝦雄蝦身上獲取精莢,精子的質量和數量不會下降．對凡納濱對蝦和細角濱對蝦(Litopenaeusstylirostris)連續獲取精莢,會導致精子數量和質量的提高[28]．

獲取精莢的時間間隔也是影響因素之一．斑節對蝦2次獲取精莢的時間間隔在15 d時,并不影響精莢的總精子數和畸形精莢的數量,所以證明15 d的間隔是安全有效的[26]．但是Sampath等[29]也對斑節對蝦的2次獲取精莢的時間間隔做了研究,結果表明只有時間間隔小于6 d時,會導致精莢質量下降．

日本囊對蝦再生精莢退化,將對實際應用產生重大影響．通過改變溫度和鹽度等環境因子、調節雌雄性比、調整獲取精莢時間間隔、進行切除眼柄、或是使用其他獲取精莢操作,能否改善再生精莢質量,延緩甚至消除精莢再生退化,將是下一步研究的重點．

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