Shewanella oneidensis MR-1異化還原Fe(III)介導的As(III)氧化轉化

汪明霞,王 娟,司友斌(安徽農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院,安徽 合肥 230036)

Shewanella oneidensis MR-1異化還原Fe(III)介導的As(III)氧化轉化

汪明霞,王 娟,司友斌*(安徽農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院,安徽 合肥 230036)

在實驗室模擬條件下,研究了Shewanella oneidensis MR-1作用下Fe(III)還原和As(III)氧化動力學及其影響因素.結果表明,Fe(III)被還原為 Fe(II)的同時伴隨著 As(III)氧化為 As(V);S. oneidensis MR-1 在含低濃度 As(III)培養(yǎng)基上生長良好,在高濃度培養(yǎng)基上生長被抑制;As(III)通過制約菌體的生長與活性來抑制Fe(III)異化還原.同樣,適量濃度的Fe(III)含量對As(III)氧化轉化有很強的促進作用,但是過高濃度的Fe(III)濃度使得溶液中產(chǎn)生過多的Fe(II),從而對As(III)氧化轉化有一定程度的抑制作用.此外,弱堿環(huán)境更有利于As(III)氧化轉化.

鐵異化還原；氫氧化鐵；As(III,V)；氧化還原

砷(As)作為一種典型的有毒元素,可致畸、致癌、致突變,并通過“三廢”進入水體和土壤而成為重要的污染源[1].在自然條件下的水體和土壤環(huán)境中,砷主要以無機形態(tài)存在,其常見價態(tài)有+3和+5價.氧化還原電位和pH值是影響水體中砷形態(tài)的主要因素[2],在還原條件下 As(III)是主要存在形態(tài);而在氧化條件下 As(V)是主要存在形態(tài).在大多數(shù)環(huán)境條件下,As(V)能夠強烈吸附于鐵鋁氧化物表面,從而限制了其移動性[3],而As(III)由于較少被吸附而具有較大遷移性,其毒性約是As(V)的60倍,故常用的污染修復處理是先將As(III)氧化為As(V).

砷對氧化還原條件變化較為敏感,其遷移轉化主要取決于環(huán)境中氧化還原條件的變化.鐵在濕地環(huán)境中的生物地球化學過程,對于氧化還原反應的調控有著十分重要的作用,其不同形態(tài)及價態(tài)的轉化對于營養(yǎng)元素、痕量金屬元素遷移轉化有直接的影響.鐵的(氫)氧化物是土壤中固定砷的主要基質,鐵的形態(tài)對砷的遷移轉化有著重要影響,微生物對鐵的氧化還原過程顯著影響砷的形態(tài)和環(huán)境行為[4].水稻中的砷,尤其是水稻根際環(huán)境中鐵的微生物還原對砷遷移轉化機制研究,越來越受到重視[5-6].奧奈達希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1)屬于革蘭氏染色陰性兼性厭氧細菌,是最先被闡明通過 Fe(III)還原使有機物氧化、獲得生長所需能量的細菌,根據(jù)細菌進化16S RNA基因的系統(tǒng)分析法,S. oneidensis MR-1已被認定為 γ-變形菌門的亞群[7],屬于鐵還原細菌.鐵在水稻土中的氧化還原過程已經(jīng)成為一個環(huán)境熱點問題,但是對于含鐵氧化物在砷污染防治中的作用,眾多的研究主要集中于砷污染環(huán)境中的微生物分離[8-9],鐵氧化物對砷的吸附共沉淀[10]等方面,對于環(huán)境中微生物參與的鐵還原和砷氧化還原之間的相互關系研究相對較少.本實驗通過對S. oneidensis MR-1進行馴化與純培養(yǎng),在實驗室模擬條件下,通過在同一反應體系中同時添加 As(III)和 Fe(III)及微生物混合培養(yǎng),探討 S. oneidensis MR-1對Fe(III)的還原及耦合As(III)氧化轉化之間的關系,以期為水體砷污染的防治提供科學依據(jù).

圖1 S . oneidensis MR-1異化還原Fe(III)介導As(III)氧化轉化Fig.1 Diagram of As(III) oxidization coupled to Fe(III) reduction by S. oneidensis MR-1

1 材料與方法

1.1 實驗材料

亞砷酸鈉(NaAsO2,純度>95%);砷儲備液(0.1mg/mL),于 4℃冰箱保存,實驗所需稀溶液用去離子水依次逐級稀釋.鹽酸、氫氧化鉀、硼氫化鉀、硫脲均為優(yōu)級純,其他試劑均為分析純.

菌種來源:S. oneidensis MR-1由西北農(nóng)林科技大學土壤微生物實驗室提供.

S. oneidensis MR-1 培 養(yǎng) 基 (g/L): KH2PO4·7H2O 3.0、Na2HPO4·7H2O 12.8、NH4Cl 1.0、NaAc 2.0、酵母抽提物2.0.

LB富集培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5.0,蛋白胨10.0, NaCl 5.0,pH值調至 7.0左右;固體培養(yǎng)基再按1.5%～2.0%的比例加入瓊脂粉,121℃滅菌30min.

1.2 實驗方法

人工合成 Fe(OH)3的制備方法:稱取 38.07g FeCl3·6H2O 于 1L大燒杯中,加入去離子水1000mL,攪拌使其溶解,滴加1mol/L NaOH溶液,控制 pH值在 7.0～7.6之間,可得紅褐色懸浮狀Fe(OH)3即為人工合成的Fe(OH)3原液.人工合成的Fe(OH)3具有比表面積大和活性高的特點.

將S. oneidensis MR-1菌懸液1mL無菌操作接種至含有液體培養(yǎng)基的棕色瓶中,添加As(III)、As(V)溶液和人工合成的Fe(OH)3原液,充氮除氧,加蓋密封.置于 30℃搖床中振蕩培養(yǎng),定期采集樣品,測定 As形態(tài)和 Fe(II)濃度變化.同時設置不添加S. oneidensis MR-1菌懸液作為對照.每處理3次重復.

菌株的厭氧培養(yǎng):在超凈厭氧工作臺上,將高純氮氣通過一個裝有細菌過濾器的塑膠管充入裝有培養(yǎng)液的棕色瓶中,充氣15min后,快速擰緊瓶蓋密封后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng).

1.3 樣品處理與測定

樣品搖勻后取 3組 5mL懸濁液:一組過0.45μm 濾膜,濾液用于分析溶解態(tài)的 As(III)和As(T)(總砷)濃度;一組加入浸提液為 1.0mol/L的鹽酸溶液,30℃恒溫振蕩溶解 1h,用一次性注射器將浸提液吸出,用孔徑為0.45μm濾膜過濾,收集濾液,用于測定總 As(III)和總 As(T)[11];另一組加入浸提液為0.5mol/L的鹽酸溶液,恒溫30℃浸提24h后,用一次性注射器將浸提液吸出,用孔徑為0.22μm濾膜過濾,收集濾液,用于測定Fe(II)濃度.

砷形態(tài)測定采用 AFS-230E雙道氫化物發(fā)生原子熒光儀(北京科創(chuàng)海光儀器有限公司),其操作條件[12]:負高壓280V、主燈電流30mA、輔燈電流30mA、載流為2%鹽酸、還原劑為0.5%氫氧化鉀+1.0%硼氫化鉀.在上述條件下,只有As(III)能夠轉化為AsH3并被原子吸收儀器檢測出來,As(T)的測定需先將 As(V)還原為 As(III), As(T)與As(III)的差值即為體系中As(V)的濃度.

Fe(II)測定采用鄰菲羅啉比色法.Fe(II)與鄰菲羅啉反應生成橙紅色的配合物,在510nm波長處測定溶液的吸光度.

氧化量及氧化率是按照溶液中被氧化的As()Ⅲ濃度即生成的 As(V)濃度計算,相關數(shù)據(jù)分析用Excel和Origin 8.0軟件處理.

2 結果與分析

2.1 S. oneidensis MR-1作用下 Fe(III)還原和As(III)氧化動力學

在30℃、pH值7.0、Fe(OH)3初始濃度為100mg/L時,在S. oneidensis MR-1作用下,溶液中Fe(II)、As(III)的變化趨勢如圖2所示.

圖2 S. oneidensis MR-1作用下Fe(III)還原和As(III)氧化動力學曲線Fig.2 Kinetics of Fe (III) reduction and As(III) oxidation by S. oneidensis MR-1

由圖 2可見,隨著 S. oneidensis MR-1對Fe(III)的還原溶解,體系中 As(III)濃度在不斷下降,至第 8d達到平衡,Fe(III)還原率為 23.75%, As(III)氧化率為 81.89%.由此可知,在 S. oneidensis MR-1作用下,Fe(III)被還原為 Fe(II)過程中,As(III)同時被氧化為 As(V),其還原速率和氧化速率均在第1d達到最大值,隨后逐漸下降隨著 Fe(III)的還原溶解,部分砷被釋放到溶液中,但整個體系中的溶解態(tài)砷呈不斷下降趨勢.添加S. oneidensis MR-1后As(III)的氧化率都遠遠大于未添加菌時的氧化率.

此外,作為對比,設置了添加 As(V)后砷的轉化實驗,在添加 As(V)后,體系中幾乎檢測不到As(III),砷均以As(V)形態(tài)存在,由于As(V)很容易吸附于鐵氧化物并與之共沉淀,溶液中的溶解態(tài)砷也呈不斷下降趨勢.此外,添加 As(V)條件下的Fe(III)還原率高于添加 As(III)的處理,主要原因是由于As(V)對鐵還原菌的毒性低于As(III).

2.2 初始As(III)濃度對S. oneidensis MR-1菌體生長及其異化還原Fe(III)的影響

在其他條件都相同,As(III)的初始濃度為0,1,2,3,4mg/L時,厭氧培養(yǎng) 48h后,As(III)濃度對S. oneidensis MR-1生長及其異化還原鐵的影響如圖3所示.

圖3 As(III)濃度對S. oneidensis MR-1菌體生長及其異化還原Fe(III)的影響Fig.3 Effect of As(III) concentration on the growth of S. oneidensis MR-1and dissimilatory iron reduction

由圖3可見,在30℃、pH 7.0的條件下,未添加As(III)時,S. oneidensis MR-1生長較快且具有較高的活性,連續(xù)培養(yǎng)2d后,菌體濃度每mL高達4.61×109個.添加1mg/L As(III)后對S. oneidensis MR-1的生長有一定程度的抑制作用,其菌體濃度每mL降至約2.12×109個.隨著As(III)濃度的增大,砷對菌株的毒性越強,當 As(III)濃度為4mg/L時,菌體濃度每mL僅為5.01×107個,說明As(III)濃度越高,對S. oneidensis MR-1生長的抑制越強.

從圖 3可以看到,在未加入 As(III)時,S. oneidensis MR-1異化還原生成的 Fe(II)濃度為15.83mg/L,即 S.oneidensis MR-1的鐵還原率為15.83%.隨著砷濃度的升高,Fe(II)生成量在不斷地下降,當As(III)濃度為4mg/L時Fe(II)的濃度僅為4.23mg/L.由此可知,As(III)濃度對鐵還原菌的生長有一定程度的抑制作用,砷可以通過抑制菌的生長與活性來制約Fe(III)的還原[13].

圖4 S. oneidensis MR-1作用下Fe(OH)3濃度對As(III)氧化轉化的影響Fig.4 Effect of Fe(OH)3concentration on As (III) oxidation in the presence of S.oneidensis MR-1

2.3 異化 Fe(III)還原介導 As(III)氧化轉化的影響因素

2.3.1 Fe(OH)3濃度對 As(III)氧化轉化的影響 當其他條件都相同時,Fe(OH)3初始濃度分

3 討論

別為10,50,100,200mg/L時,在S.oneidensis MR-1作用下,對As(III)氧化轉化的影響如圖4所示.在30℃、pH 7.0的條件下,四種體系中,均有大量的As(V)生成,其濃度分別為 670.4,751.0,818.9, 799.7μg/L.在第 1d,As(III)氧化速率最高,其氧化率均達到50%左右,隨后氧化速率開始下降,到第8d達到平衡.說明S.oneidensis MR-1作用下,不同F(xiàn)e(OH)3濃度對As(III)的氧化轉化有一定的影響.隨著 Fe(OH)3濃度的增大,As(III)的氧化速率越大,其氧化率越高,但是,當濃度大于 100mg/L時,As(III)氧化率反而減小.由此可知,Fe(OH)3濃度的增大能夠促進 As(III)的氧化,但當其濃度超出一定值時,反而會抑制As(III)的氧化轉化.這可能與鐵還原過程導致氧化還原電位的變化相關[14-15],過高的 Fe(III)濃度使得溶液中產(chǎn)生過多的 Fe(II),影響了反應體系中的氧化還原電位,從而對As(III)氧化轉化產(chǎn)生了抑制作用.

2.3.2 pH 對As(III)氧化轉化的影響 初始pH值分別為 5.0,6.0,8.0,9.0時,Fe(OH)3濃度為100mg/L時,在 S.oneidensis MR-1作用下,對As(III)氧化的影響如圖5所示.實驗結果表明,當pH 值為 8.0時,溶液中 As(V)濃度最大,為848.0μg/L, pH值為5.0時最小,僅為592.7μg/L,其次為pH值為9.0和pH值為6.0.說明pH值對As(III)氧化轉化具有明顯影響,當pH值在弱酸性至弱堿性范圍內,As(III)氧化量呈逐漸上升趨勢,并在pH值為8.0時達到最大氧化量,當pH值為9.0時,As(III)氧化量略有下降.隨著pH值的變化, As(III)在鐵氧化物表面的吸附量發(fā)生變化,因此導致氧化量也隨之變化.

綜上所述,在本實驗條件下,當Fe(OH)3添加濃度100mg/L、pH為8.0時,As(III)氧化轉化效率最高,即最有利于As(III)的氧化轉化.

促使 Fe(III)還原的主要動力是微生物的作用,同時,重金屬離子也可能成為制約 Fe(III)還原的重要因素,重金屬對異化 Fe(III)還原的抑制取決于微生物的活性和重金屬離子的種類及濃度[16].As(III)抑制異化 Fe(III)還原還可能是由于其對S. oneidensis MR-1的毒害作用抑制了糖代謝,使S. oneidensis MR-1得不到足夠的電子供體,從而影響降低了鐵還原率.另外,由于As(III)的氧化轉化使得溶液中有 As(V)存在,實驗證明[17],添加不同濃度 As(V)后 Fe(III)還原過程有明顯的“滯后”,且隨著As(V)濃度的增加,這種“滯后”作用就越明顯.

圖5 S. oneidensis MR-1作用下pH值對As(III)氧化轉化的影響Fig.5 Effect of pH on As (III) oxidation in the presence of S. oneidensis MR-1

在本次試驗中,未添加S. oneidensis MR-1對照組的As(III)氧化率均遠遠小于添加菌后的氧化率,說明添加S. oneidensis MR-1后能夠明顯促進As(III)氧化轉化,且鐵還原速率與As(III)氧化在時間分布上呈現(xiàn)出相同趨勢.As(III) 被O2氧化是一個非常緩慢的過程[18],即便有大量的O2存在也無法解釋實驗中 As(III)被迅速氧化的原因.并且,本實驗是在厭氧條件下進行的,排除了 Fenton反應和由于 Fe(II)和 O2氧化 As(III)的可能性[19-20]. Amstaetter等[21]研究表明,在Fe(OH)3和Fe(II)同時存在的條件下,As(III)可以被氧化為As(V),相對于其他Fe(III)氧化物,Fe(OH)3和Fe(II)同時存在、相互作用下能夠表現(xiàn)出最高氧化還原活性.在本實驗過程中可能是由于S. oneidensis MR-1異化還原Fe(III)形成的Fe(OH)3-Fe(II)復合物引起電子由 Fe(II)到 Fe(OH)3的傳遞,從而形成了一種Fe(OH)3-Fe(III) 活性中間復合物,形成的 Fe(III)具有潛在的強氧化能力,可以作為一種強氧化劑使As(III) 發(fā)生氧化[22].然而,As(III)不可能被徹底氧化為 As(V),隨著培養(yǎng)時間的變化,As(III)和As(V)總是共同存在的,其含量存在著動態(tài)平衡關系[15].As(III)在鐵氧化物表面的氧化作用是伴隨著吸附作用而進行的.As(III)通常以 H3AsO3的分子形態(tài)存在于水溶液中,而在弱堿性環(huán)境中,H3AsO3分子更容易解離形成亞砷酸根離子[23],在鐵氧化物表面的吸附效果要優(yōu)于酸性和強堿性條件下的吸附效果,進而有利于 As(III)的氧化轉化.As(III)和 As(V)的存在形式主要取決于氧化還原電位的高低和pH值的大小.一些研究發(fā)現(xiàn)在厭氧的自然環(huán)境中存在著As(V).由于環(huán)境中鐵還原微生物廣泛存在,尤其是在厭氧的自然條件下分布廣泛,只要鐵(氫)氧化物和 Fe(II)同時存在的條件下,As(III)就可以發(fā)生氧化,這可能就是缺氧的地下水中 As(V)存在的原因.有研究表明,As(V)在某些湖泊的缺氧均溫層中占主導[24].此外,鐵還原產(chǎn)生的 Fe(II)能與鐵氧化物作用生成鐵的多價態(tài)次生礦物,這些多價態(tài)次生礦物對砷有強烈的吸附作用,且氧化生成的As(V)更容易被Fe(OH)3及其他礦物吸附共沉淀,從而可以有效地抑制砷的遷移,降低砷污染.

越來越多的研究表明,在自然水體和土壤中,微生物參與As(V)和As(III)之間氧化還原轉化過程中起著關鍵作用,而且微生物催化作用遠大于非微生物[25],因此,進一步深入研究有望在土壤中微生物鐵還原和砷的氧化還原方面展開.

4 結論

4.1 厭氧培養(yǎng)過程中,Fe(III)被還原為 Fe(II)的同時伴隨著 As(III)氧化為 As(V),并且這兩個過程在時間上有高度的一致性.

4.2 As(III)濃度對S. oneidensis MR-1菌株生長有一定的抑制作用,隨著 As(III)濃度的增大,菌株生長量明顯減少.添加 As(III)后降低了 S. oneidensis MR-1鐵還原率,As(III)可以通過制約菌的生長與活性來抑制Fe(III)異化還原.

4.3 適量的Fe(III)含量對As(III)氧化轉化有很強的促進作用,但是過高的 Fe(III)濃度使得溶液中產(chǎn)生過多的 Fe(II),從而對 As(III)氧化轉化有一定程度的抑制作用.當 Fe(III)濃度為 100mg/L時,As(III)氧化轉化率最高,達81.89%.

4.4 相對于酸性或者強堿性,弱堿性環(huán)境更有利于As(III)氧化轉化,其中pH值為8.0時,As(III)氧化轉化率最高,達84.80%.

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As(III) oxidization coupled to Fe(III) reduction by Shewanella oneidensis MR-1.

WANG Ming-xia, WANG Juan, SI

The kinetics of Fe (III) reduction and As (III) oxidation by Shewanella oneidensis MR-1 and influenced factors were studied under laboratory conditions. Results showed that the oxidization of As (III) to As (V) occurred in accompanying with Fe (III) reduction, S. oneidensis MR-1 could grow well at low concentration of As (III), but its growth was suppressed at high concentration of As (III). As (III) inhibited dissimilatory iron reduction by affecting the growth and activity of S. oneidensis MR-1. Moreover, moderate Fe (III) could strongly promote As (III) oxidization, while high Fe (III) concentration might inhibit As (III) oxidization because of excess Fe (II). In addition, weak alkaline environment was more conducive to As (III) oxidization.

dissimilatory iron reduction；Fe(OH)3；As(III,V)；redox

X172

A

1000-6923(2014)09-2368-06You-bin*(School of Resources and Environment, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China). China Environmental Science, 2014,34(9)：2368～2373

汪明霞(1989-),女,安徽安慶人,安徽農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院碩士研究生,主要研究方向為環(huán)境污染防治.

2014-01-13

國家自然科學基金項目(41171254);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費課題(201303101-06)

* 責任作者, 教授, youbinsi@ahau.edu.cn