利用RFLP分析DO對附積床系統中AOB群落結構的影響

張 巖,朱 敏,劉煥光,孫鳳俠,甘志明,陳 敬,史 楊,謝杭冀 (北京工業大學,北京市水質科學與水環境恢復工程重點實驗室,北京 100124)

利用RFLP分析DO對附積床系統中AOB群落結構的影響

張 巖*,朱 敏,劉煥光,孫鳳俠,甘志明,陳 敬,史 楊,謝杭冀 (北京工業大學,北京市水質科學與水環境恢復工程重點實驗室,北京 100124)

為了解析DO濃度對附積床反應器脫氮系統中COD、NH4+-N、TN去除效率的影響,以及對氨氧化菌群(AOB)結構及多樣性的影響,分析了DO分別為1.0～2.0,2.0～3.0,3.0～4.0mg/L時COD、NH4+-N、TN去除效率,并采用針對AOB功能基因氨單加氧酶(amoA)的限制性內切酶片段長度多態性技術(RFLP)分析了三組DO濃度下反應器中AOB的群落結構及多樣性.結果表明,不同DO條件下,系統均取得較高的COD和NH4+-N的去除效果, NH4+-N的去除效率隨著DO的增加而提高.不同DO濃度下反應器生物膜上AOB菌群多樣性豐富,且與DO對AOB菌群的多樣性影響較小相比,DO對AOB的菌群結構及種類的影響較大.

氨氧化細菌(AOB)；amoA基因；RFLP；生物膜

同時硝化反硝化(SND)的硝化過程首先在氨氧化細菌(AOB)的作用下,NH4+被氧化成 NO2-,繼而通過亞硝酸氧化菌(NOB)將NO-氧化為NO-.23由于AOB細菌是影響硝化過程穩定性的主要微生物[1],且氨氧化作用成為硝化過程的起始和限速步驟[2],因此深入了解氨氧化細菌種類、種群結構及數量變化,有針對性地對系統進行優化調控,是確保脫氮處理系統穩定、高效運行的關鍵.

AOB生長速度極為緩慢,傳統分離純化方法限制了對硝化細菌的研究與應用.由于熒光原位雜交技術(FISH)、熒光實時定量 PCR、PCR-DGGE、T-RFLP等分子生物學技術避開了傳統微生物培養分離環節,采用直接從樣品中提取所含微生物總DNA,對DNA進行分析,這些技術已經成為現代環境微生物學研究的重要手段.如Dong等[3]利用技術研究了濕地處理豬廢水系統中氨氧化細菌的種類. Winkler等[4]利用FISH、定量PCR技術分析了好氧顆粒污泥中AOB與NOB細菌比例不同的原因.Park等[5]利用 FISH技術研究了溶解氧對活性污泥中AOB菌群結構的影響.但是目前對于SND反應器中DO對AOB菌群結構以及AOB細菌的種類組成影響的研究報道較少.

附積床系統是在反應器中懸掛Bio-fix填料的生物膜與活性污泥并存的系統,Bio-fix填料可以形成厚度適中的生物膜.本課題組在前期研究中,采用 PCR-DGGE、FISH技術研究了不同C/N[6]、碳源[7]、HRT[8]、DO[9]等條件下附積床系統中微生物菌群群落結構及空間分布,但對附積床系統中AOB菌群結構、多樣性及種類組成還未有研究.

DO是 SND的重要影響因素之一,研究表明

[10-12],SND系統中DO濃度為1～3mg/L時,系統脫氮效果較好.本研究將反應器 DO分別設定為1.0～2.0mg/L、2.0～3.0mg/L、3.0～4.0mg/L,對不同DO濃度下附積床反應器的COD、NH4+-N、TN去除效果進行研究,并利用限制性內切酶段長度多態性技術(RFLP)技術分析不同 DO條件下反應器中AOB的群落結構、多樣性及種類的組成和變化.

1 材料與方法

1.1 實驗裝置與填料

圖1 附積床生物膜反應器Fig.1 Schematic diagram of catching bed biofilm reactor

如圖 1所示.反應器裝置主體包括原水箱、SND反應器、二沉池.反應器主體及二沉池有效容積分別為12L和16L.SND反應器內部為單槽結構,進水由蠕動泵供入底部,中間懸掛兩片bio-fix填料,上部設出水口,依靠重力作用流入二沉池.二沉池為豎流式二沉池中間進水,外圍出水,池底污泥依靠蠕動泵回流到反應器中.實驗中采用的高親水性生物填料 Bio-fix(BX) 主要材質為丙烯酸樹脂纖維,具有很高的孔隙率和比表面積,填料的特征參數如表1所示.其表面粗糙的紋理及填料內部所撐開的空間結構,使填料能很好地固定生物膜,其上黏附的生物膜不易大面積脫落.同時,在填料中氣水可以在其中自由流動,可有效防止污泥在填料上堵塞結塊,保證生物膜內部微生物活性.

表1 填料技術參數Table 1 Characteristics of the carrier

1.2 原水水質、運行參數及分析方法

實驗用原水為生活用水,取自北京工業大學西區教工生活小區化糞池上清液,ρ(COD)=159.5～675.7mg/L,ρ(NH4+-N)=55.4～116.4mg/L,ρ(TN)=61.0～119.6mg/L.

運行參數為 HRT=8h,污泥回流量為 100%,三組平行反應器 DO 分別為 1.0～2.0, 2.0～3.0, 3.0～4.0mg/L.

COD采用5B-3型快速測定儀;NH4+-N采用納氏試劑光度法測定;NO-2-N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測定;NO3--N采用紫外分光光度法測定;DO、溫度采用WTW DO測定儀測定;pH值測定采用METTLER TOLEDO LE438pH計.

1.3 DNA提取

將取自生物膜上的污泥樣品在5000g下離心3min,取離心后樣品0.3g置于2mL離心管中,DNA樣品采用土壤DNA提取試劑盒(生工生物,上海)提取,最終DNA提取液為80μL.電泳前用核酸染料Gelred將瓊脂糖染色,130V,30min電泳完成后用去離子水漂洗,在254nm的紫外下觀察.

1.4 PCR擴增

對于AOB的擴增,選用針對功能基amoA的引物amoA-1F(5’-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3’)和 amoA-2R (5’-CCCCKCKGSAAAGCCTTCTTC-3’;K表示G或T;S表示C或G)[13].PCR反應體系為50μL,包括2μL模板DNA,5μL 10× PCR buffer,4μL dNTP混合液(各2.5mmol/L),上、下游引物(10pmol/μL)各 2μL,0.25μL Tap酶(5U/ μL,TaKaRa,日本),加雙蒸滅菌水至50μL.PCR擴增程序如下:94℃預變性5min;94℃變性60s,50℃退火 90s,72℃延伸 90s,共 40個循環;72℃延伸10min.擴增產物采用 Agarose Gel DNA purification kit A劑盒(生工生物,上海)進行純化,純化過程按照試劑盒說明書進行.

1.5 amoA基因克隆及RFLP分析

將純化后的PCR產物鏈接到pMD18-T載體(生工生物,上海)上,再轉化到 Escherichia coli JM109(TaKaRa,日本)細胞中,質粒的轉化、克隆方法參考pMD18-T Simple Vector說明書.藍白斑篩選分別挑取80個白色菌落轉接到另一培養基平板上.以挑選的克隆菌落為模板,用pMD18-T載體引物RV-M和M13-47作為PCR引物,檢驗篩選的克隆是否插入正確長度的片段.片段大小正確的amoA基因PCR產物用MboI (TaKaRa,日本)限制性內切酶進行酶切.酶切體系為10μL,包括PCR產物5μL, MBoI 1μL,ddH2O 4μL,酶切反應于 37°C條件下進行 1h.酶切產物用濃度為2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗,在凝膠成像系統中凝膠成像.凝膠成像結果中 RFLP分型相同的劃分為一個操作單元(OUT).

1.6 測序與序列系統發育學分析

每個OTU選取一個代表菌株送往上海生工生物公司進行測序.獲得的 amoA基因序列與GenBank 進行比對(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast),選取具有代表性且同源性較高的序列,利用MEGA4.0構建系統進化樹.

1.7 物種多樣性分析

基于限制性酶切分析結果,對3組反應器中群落的α多樣性指數進行分析.3種α多樣性指數Shannon Wiener指數、Simpson指數和均勻度指數的計算公式分別為:H=-∑(Pi)(log2Pi);D=1-∑Pi2,Pi=Ni/N;E=H/lnS.式中H:Shannon Wiener指數,D:Simpson指數,E:均勻度指數,Ni:為第i種酶切類型所包含的克隆數,N:總克隆數,Pi=Ni/N,S:群落中總物種數.

2 結果與討論

2.1 反應器運行情況

如表 2所示,DO=1.0～2.0mg/L時,反應器中COD去除率為86.4%,NH4+-N去除率為89.21%, TN去除率為 33.37%;當 DO=2.0～3.0mg/L時, COD、NH4+-N和 TN的去除率均有所增加;當DO增加至3.0～4.0mg/L時,COD、NH4+-N和TN去除率分別為 87.3%、99.31%和 29.67%.在反應器運行過程中,系統受到持續性的沖擊負荷,期間進水 COD最高達 675.1mg/L,NH4+-N最高達116.4mg/L,這種情況持續了17d,造成系統COD、NH4+-N、TN處理能力有所降低,但在沖擊負荷消失后,系統處理能力恢復較快,說明該系統承受沖擊負荷能力強,且調節能力強.從整體上看,不同DO條件下系統都取得了良好的有機物及氨氮去除效果,氨氮去除效率隨著DO的增加而提高.

表2 不同DO條件下COD、NH4+-N、TN去除效果Table 2 COD, NH4+-N and TN removal efficiency under different DO concentrations

2.2 amoA基因的RFLP分析

在3組反應器的187個陽性克隆子中,通過酶切分型,一共得到 29個 OTUs,其中 DO=1～2mg/L時:61個陽性克隆子,8個OTUs; DO=2～3mg/L時:63個陽性克隆子,12個OTUs; DO=3～4mg/L時:60個陽性克隆子,9個OTUs.

從圖2可以看出,同時存在于3組反應器的OTU只有1個,同時存在于兩個反應器中的OTU有 7個.此外,每個反應器中都存在獨有的 OTU類型, DO=1～2mg/L(圖中M1)、DO=2～3mg/L(圖中M2)、DO=3～4mg/L(圖中M3)反應器中獨有的OTU分別為2個、7個和5個,這些數據表明,不同 DO條件下微生物群落構成有較大的變化.3組反應器中獨有 OTU分別占各組反應器 OTU總數的25%(M1)、58.3%(M2)和55.6%(M3),這些獨有 OTU的克隆數占其文庫的 41.0%(M1)、25.4%(M2)和35.0%(M3),說明3組反應器在氨氧化細菌構成方面相差較大,每組反應器都含有其特有的操作單元,然而從克隆數來看,這些特有的操作單元并沒有成為系統中的優勢氨氧化菌群.對每組反應器中含有陽性克隆子數目前三位的OTU進行分析,其陽性克隆子數總和分別占各組反應器中總克隆子數的70.5%(M1)、69.8%(M2)、71.7%(M3),其中,M1反應器中30.2%的克隆子為獨有OTU,M3反應器中僅有 23.3%的克隆子數屬于獨有OTU,其余克隆子同時存在于兩個反應器中或同時存在于 3個反應器中,說明本實驗中各組反應器均存在優勢氨氧化菌群,DO對氨氧化菌群有一定的篩選功能.

圖2 不同DO濃度下反應器中氨氧化細菌amoA基因酶切類型關系的文氏圖Fig.2 Venn diagram showing relationships between three different DO concentrations in RFLP pattern-based amoA gene OTUs

2.3 amoA基因文庫的多樣性分析

評價生物多樣性的高低時,同時要考慮到物種的豐富度與均一度.環境種類豐富度越高均一度越高,則物種的多樣性越高.Shannon-Wiener指數和Simpson指數既考慮到了物種數,同時也考慮到每個物種的相對多度.

表3 不同DO濃度下樣品amoA基因文庫α多樣性指數Table 3 α diversity index of the amoA gene libraries from three samples collected at different DO concentrations

由表 3可見,DO=2.0～3.0mg/L時,Shannon-Wiener指數和Simpson指數均為最高,但是三組反應器變化不明顯,說明不同DO濃度下,反應器中的物種多樣性均較高,DO對物種多樣性影響較小.該結果與在現有的研究報道相似, Magdalena等[14]采用 PCR-DGGE研究發現當DO從0.5mg/L提高到1.5mg/L,反應器中AOB菌群相似度基本不變,Princic等[15]通過對菌群rDNA進行限制性酶切分析發現1%、7%、21%的氧飽和度下反應器中AOB生物多樣性基本相同.從均勻度指數看,DO為2.0～3.0mg/L時,均勻度指數最高,DO=1.0～2.0mg/L 和 DO=3.0～4.0mg/L時均勻度指數差異不大,說明AOB群落結構能較好地適應 DO為 2.0～3.0mg/L的環境,物種較為均勻.

通過比較不同DO條件下NH4+-N的去除效果發現,NH4+-N的去除效率隨著DO的增加而提高,說明氨氧化作用基本不受氨氧化細菌多樣性的影響,有研究表明氨氧化作用主要與氨氧化細菌在活性污泥中占的比例、活性以及種類有關[14,16].

2.4 AOB系統發育分析

將測序后的克隆子基因片段在 NCBI網站上進行 BLAST比對,發現大部分克隆子比對后與最近物種相似度在 90%以上.比對得到的菌群均屬于Nitrosomonas,這是因為Nitrosomonas有較快的增長速度,如 N.europaea,其μmax為0.088h-1,而 Nitrosospira 的μmax 為 0.033～0.035h-1[17],這種生長優勢可能使Nitrosomonas更容易成為活性污泥和生物膜系統中優勢AOB[18],這與已有的研究報道結論相似[19-21].由圖 3～圖 5可以看出不同DO濃度下,系統中AOB細菌種類發生了較大的變化,當DO=1.0～2.0mg/L時,OTU經對比找出7種AOB細菌,當DO=2.0～3.0mg/L時,OTU經對比找出9種AOB細菌種類,而當DO提高到3.0～4.0mg/L時,OTU經對比只找出4種AOB細菌.這可能是因為DO=1.0～2.0mg/L的低溶解氧濃度環境限制了部分 AOB菌群的生長,不適應環境的菌群被淘汰,DO為2.0～3.0mg/L是AOB菌群最佳生長環境,更多的AOB菌群逐漸適應這種生長環境,AOB菌群種類豐富度提高,而當DO為3.0～4.0mg/L時,AOB菌群之間的內部競爭激烈,不適應外界環境的菌種被逐漸淘汰,其空出的生存空間被其他種類的AOB菌群所替代,AOB種類減少.

圖3 DO=1.0～2.0mg/L amoA基因的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on amoA gene at DO =1.0～2.0mg/L

圖4 DO=2.0～3.0mg/L amoA基因的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on amoA gene at DO =2.0～3.0mg/L

3組反應器中,AOB組成存在一定的差別,DO為1.0～2.0mg/L時,主要由N. oligotropha cluster(約占 88.5%)組成,同時還存在 N. communis cluster(約 占 4.9%)和 unknown Nitrosomonas cluster(約占6.6%),在DO為2.0～3.0mg/L的反應器中,N. oligotropha cluster(約占73.8%)占絕對優勢,同時存在部分 unknown Nitrosomonas cluster(約占 16.2%),而在 DO 為3.0～4.0mg/L的反應器中,僅存在 N. oligotropha cluster,這種差異是由 DO濃度引起的,說明 N. communis cluster具有在低DO環境中生存的優勢,這與已有的研究的結論相似[22],同時也表明,在 3組反應器中,N. oligotropha可能是優勢菌群.有文獻指出,N. oligotropha cluster對NH4+-N的Ks 較低,在0.027～0.059mg/L之間[23],此類AOB細菌適宜在低NH4+-N濃度的污水處理系統中,但本實驗進水平均 NH4+-N濃度達 85.5mg/L,說明 N. oligotropha cluster的AOB細菌對NH4+-N濃度的耐受度不同,部分N. oligotropha cluster的AOB細菌能適應高濃度NH4+-N環境,具體種類和原因還需進一步的研究.

3組反應器均有較高的氨氮去除效率,且各反應器中AOB菌群主要由N. oligotropha cluster的AOB組成(3組反應器分別占總陽性克隆子數的 88.5%、73.8%、100%),說明 N. oligotropha cluster的AOB可能是去除氨氮的主要菌群.

圖5 DO=3.0～4.0mg/L amoA基因的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on amoA gene at DO =3.0～4.0mg/L

3 結論

3.1 DO濃度為1.0～2.0,2.0～3.0和3.0～4.0mg/L的反應器中,COD去除效率分別為86.4%,87.5%和 87.3%,NH4+-N 去除效率分別達 89.21%, 92.02%和99.31%,說明不同DO濃度下,系統均取得較高的COD和NH4+-N的去除效果, NH4+-N的去除效率隨著DO的增加而提高.

3.2 對不同DO條件下反應器中AOB細菌進行多樣性分析,由α多樣性指數可以看出,3組反應器生物膜上AOB菌群多樣性豐富,DO對AOB菌群的多樣性影響較小.

3.3 DO對AOB的菌群結構和種類組成產生了較大的影響.在 3組反應器中,均存在 N. oligotropha cluster,且為優勢菌群,在低濃度 DO條件下,還存在N. communis cluster和unknown Nitrosomonas cluster,均屬于Nitrosomonas.

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Analysis of ammonia-oxidizing bacteria in catching bed reactor at different DO concentrations by RFLP

Z HANG Yan*, ZHU Min, LIU Huan-guang, SUN Feng-xia, GAN Zhi-ming, CHEN-Jing, SHI-Yang, XIE Hang-ji (Key Laboratory of Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China). China Environmental Science, 2014,34(9)：2387～2393

To investigate the influence of DO concentration on the characteristics of catching bed reactor, the removal efficiency of COD, NH4+-N and TN were analyzed under the DO concentrations at 1.0～2.0mg/L, 2.0～3.0mg/L and 3.0～4.0mg/L, respectively. Meanwhile, ammonia-oxidizing bacteria (AOB) community and diversity in each reactor were examined using restricted fragment length polymorphism (RFLP), and sequencing of amoA genes. The results showed that higher COD and NH4+-N removal efficiency were

under different DO concentrations, NH4+-N removal efficiency increased with the DO concentration increase. The diversity of AOB was abundant in different DO concentrations, but the communities and species of AOB were effect greatly by DO concentration.

ammonia-oxidzing bacteria (AOB)；amoA gene；RFLP；biofilm

X172

A

1000-6923(2014)09-2387-07

張 巖(1962-),女,山東煙臺人,副教授,博士,主要從事污水處理與資源化方面的研究.

2014-01-22

國家自然科學基金資助項目(50978004)

* 責任作者, 副教授, yzhang@bjut.edu.cn