高效液相色譜法測定精制銀翹解毒片中連翹苷的含量

吳 娟

高效液相色譜法測定精制銀翹解毒片中連翹苷的含量

吳 娟

目的 建立測定精制銀翹解毒片中連翹苷含量的方法。方法 采用高效液相色譜法（HPLC）測定，使用C18柱（Diamonsil ODS，200.0 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫箱35 ℃，以乙腈-水（24:76）為流動相，檢測波長230 nm；流速為1 ml/min。結果 采用HPLC測定連翹苷含量，連翹苷在0.0967～0.9670 μg范圍具有良好的線性關系；連翹苷平均回收率為99.1%。結論 高效液相色譜法靈敏度高，重復性好，所建立的連翹苷含量測定方法能有效控制銀翹解毒片的質量。

精制銀翹解毒片；連翹苷；高效液相色譜法；含量測定

精制銀翹解毒片收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第三冊，由金銀花、連翹、對乙酰氨基酚等組成，具有清熱散風、解表退熱功能，用于流行性感冒、發冷發熱、四肢酸懶、頭疼咳嗽、咽喉腫痛、溫毒發斑、臉腮赤腫。原標準采用了紫外分光光度法只測定了對乙酰氨基酚的含量，鑒別也只有對乙酰氨基酚的薄層鑒別，對處方中其他中藥無任何控制指標，而金銀花的有效成分綠原酸在測定波長249 nm也有紫外吸收，必然影響對乙酰氨基酚含量測定的準確度[1-3]。通過測定不同廠家的制劑發現，個別廠家的精制銀翹解毒片根本無法檢測到連翹苷。通過高效液相色譜法（HPLC）測定精制銀翹解毒片中的對乙酰氨基酚和綠原酸含量頗多，本文采用HPLC法測定精制銀翹解毒片中的連翹苷含量可用于該制劑的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 實驗材料 連翹苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號110821-200610）；精制銀翹解毒片（太極集團四川綿陽制藥有限公司，批準文號：國藥準字Z51020282，批號：55120004）；缺連翹的陰性樣品自制。

1.2 實驗試劑 乙腈（色譜純）；甲醇（分析純）；乙醇（分析純）；中性氧化鋁。

1.3 實驗儀器 Agilent Technologies 1260 高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1260紫外檢測器、四元泵、二極管陣列檢測器1260Infinity、自動進樣器）；Diamonsil C18柱（Diamonsil ODS，200.0 mm ×4.6 mm，5 μm）；AY120電子天平（SHIMADZH）；CH-250型超聲清洗機（北京創新德超電子研究所）。

2 方法與結果

2.1 檢測波長選擇 參考《中華人民共和國藥典》一部（2010年版），單味藥連翹的有效成分連翹苷含量測定檢測波長為277 nm[4-5]，測定連翹的指標性成分連翹苷的檢測波長為230 nm，在試驗過程中，連翹苷的檢測波長在230 nm時吸收值較277 nm大且無干擾，所以在精制銀翹解毒片中連翹苷含量測定選擇檢測波長為230 nm。

2.2 色譜條件 Diamonsil C18柱（Diamonsil ODS，200.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈:水（24:76）；檢測波長230 nm；流速1.0 ml/min；柱溫：35 ℃。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 ml甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理10 min，放置室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取濾液25 ml置蒸發皿中蒸至微干，加入0.5 g中性氧化鋁拌勻，加在中性氧化鋁柱（100～200目，1 g，內徑1.0～1.5 cm）上，用70%乙醇80 ml洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣加50%甲醇適量使溶解，轉移至10 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 對照品溶液的制備 精密稱取連翹苷0.00967 g，置20 ml量瓶中，加甲醇溶液并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液，精密量取上述貯備液1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.5 系統適用性試驗 分別取連翹苷對照品溶液、供試品溶液和缺連翹的陰性空白溶液注入液相色譜儀，記錄色譜（圖1～3），從圖中可見，連翹苷在該條件下，保留時間為20.8 min，陰性空白色譜圖在連翹苷位置處無干擾峰，連翹苷和其他相近的峰完全分離（分離度＞1.5），即本試驗條件下連翹苷與其他組分分離完全，理論塔板數以連翹苷計算為3000。

圖1 連翹苷對照品

圖2 精制銀翹解毒片樣品

圖3 精制銀翹解毒片連翹空白樣品

2.6 提取時間的確定 考察甲醇為溶劑，比較不同超聲提取時間，結果提取10 min、20 min、30 min連翹苷含量無明顯差異，故從工作效率考慮選取超聲提取10 min（表1）。

表1 不同超聲時間連翹苷的提取結果

2.7 線性關系考察 分別精密吸取連翹苷對照品溶液（0.04835 mg/ml）2 μl、5 μl、10 μl、15 μl、20 μl進樣，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，連翹苷進樣量（μg）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程：y（連翹苷）=2073.3x+9.0691，R2=0.9999；連翹苷進樣量在0.0967～0.9670 μg范圍內與峰面積具有良好線性關系（圖4）。

圖4 連翹苷線性關系

2.8 精密度試驗 精密吸取連翹苷對照溶液（0.04835 mg/ml）10 μl，分別進樣5次，連翹苷峰面積相對標準偏差（RSD）為0.68%，結果表明精密度良好（表2）。

2.9 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣10 μl，連翹苷峰面積RSD為0.66%，說明溶液在24 h內測定穩定（表3）。

2.10 復性試驗 取同一批次供試品6份（55120004），按2.3項下操作制得供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣分析并記錄峰面積，結果表明本方法重復性良好，見表4。

表2 精密度試驗(n=5)

表3 穩定性試驗(n=6)

表4 穩定性試驗(n=6)

2.11 回收率試驗 取6份已知含量的同一批樣品（55120004）各約1 g，精密稱定，置50 ml容量瓶中，加入適量對照品溶液，按2.3項制備供試液，按2.2色譜條件進樣，記錄峰面積，計算回收率。結果平均回收率為99.1%，RSD為0.71%，見表5。

表5 加樣回收試驗結果(n=6)

2.12 樣品含量測定 依法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10 μl，注入高效液相色譜儀，按上述方法測定，樣品（55120004）含連翹苷為每片0.1565 mg，精制銀翹解毒片平均片重為0.2680 g。

3 討論

3.1 連翹主要含有連翹苷、連翹脂、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸等多種成分，參考有關資料，鑒別連翹多選擇連翹苷作為本品含量測定的控制指標。測定連翹苷的含量，所采用的方法有紫外分光光度法、薄層掃描法等，但以上方法誤差較大，而采用HPLC法測定連翹苷含量，色譜條件如上文所述，連翹苷與其他組分分離度好，重復性，精密度，回收率高。故選用HPLC測定連翹所含的有效成分連翹苷。

3.2 確定色譜條件時，用不同的色譜柱和不同品牌的高效液相色譜儀要達到良好的分離效果所使用的流動相比例不同，但比例波動不會很大。在實際工作中，參照藥典進行檢驗時也可根據色譜圖分離度的好壞對流動相比例進行調節。

3.3 有文獻表明，用HPLC測定連翹中的連翹苷含量曾有不經過過氧化鋁柱的過程，此法在進行藥品檢驗過程中雖然簡化了檢測過程，節省了工作時間，但藥品對色譜柱的損害較大，明顯縮短了色譜柱的使用壽命。所以，此方法不可取。

3.4 在試驗過程中，曾采用40、60、80 ml 70%乙醇洗脫，結果發現在氧化鋁柱中，40 ml 70%的乙醇便可洗脫完畢，但在實際操作過程中，蒸發皿蒸至漸干后用氧化鋁拌干過程中有大量的物質殘留于蒸發皿內，需用洗脫液溶解過柱，按照少量多次的原則進行清洗，要保證洗脫完全，則洗脫液應控制在80 ml左右。

參與文獻

[1] 中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準中藥成方制劑(第三冊)[M].北京: 中華人民共和國衛生部藥典委員會,2001:198-198.

[2] 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:159-159.

[3] 俞崇靈.連翹抗菌成分的研究[J].藥學學報,1960,8(6):241-244.

[4] 蘇永林,陳卓,姚靜.高效液相法測定桑菊感冒合劑中連翹苷的含量[J].河南中醫,2012,32(7):920-921.

[5] 李會.勤清喉咽合劑中連翹苷的含量測定[J].當代醫學,2011, 17(3):51-52.

Content determination of forsythin in JinzhiYinQiaojiedu tablets by HPLC

Wu Juan

Objective To establish a method for content determination of forsythin in Yinqiaojiedu tablets.Methods Using HPLC,usingC18column( Diamonsil ODS,200.0 mm×4.6 mm,5 μm),35 ℃ column temperature box,using acetonitrile and water(24:76) as mobile phase,the detection wavelength was 230nm;the flow rate was 1 ml/min.Results Using high performance liquid chromatographydetermination of phillyrin in Forsythia rule,has a good linear relationship in the range of 0.0967～0.9670 μg phillyrin;the average recovery rate was 99.1%.Conclusion The HPLC method has high sensitivity,good reproducibility,can be used for the quality control of Yinqiao Jiedu tabletmethod for determination of phillyrin the.

YinQiaojiedu tablets;Forsythin;HPLC;Content determination

R927.2

A

1673-5846(2014)08-0017-03

畢節市食品藥品檢驗所，貴州畢節 551700