“拔伸松動手法”對膝骨性關節炎兔白細胞介素1β和腫瘤壞死因子α的影響

王春林 向勇 田啟東 胡鸞 趙志勇 邵長麗 董有康 趙永康 林云

·論著·

“拔伸松動手法”對膝骨性關節炎兔白細胞介素1β和腫瘤壞死因子α的影響

王春林 向勇 田啟東 胡鸞 趙志勇 邵長麗 董有康 趙永康 林云

目的研究拔伸松動手法對膝骨性關節炎兔膝關節液中白細胞介素1β(interleukin 1 beta, IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)的影響。方法采用隨機數字表法分為4組，即為拔伸松動手法組、注射透明質酸鈉組、模型組，正常組。拔伸松動手法組手法治療，每天一次，治療十天后休息一天，共治療6周；注射透明質酸鈉組注射治療，每周一次，共治療6周；模型組正常喂養、正常組給正常喂養。結果治療后各組關節液中IL-1β濃度平均數值為模型組>正常組>注射透明質酸鈉組>拔伸松動手法組；TNF-α濃度平均數值為模型組>拔伸松動手法組>注射透明質酸鈉組>正常組。用方差分析及LSD-t進行兩兩比較分析顯示，拔伸松動手法組、正常組、注射透明質酸鈉組兩個指標與模型組比較均為P<0.05，差異有統計學意義；拔伸松動手法組、注射透明質酸鈉組、正常組之間兩兩比較比較，兩個指標均為P>0.05，差異無統計學意義。結論拔伸松動手法和注射透明質酸鈉，均能降低膝骨性關節炎兔關節液中IL-1β、TNF-α的濃度，但兩種方法之間不能認為有差異。拔伸松動手法可能通過降低膝骨性關節炎兔關節液中的IL-1β、TNF-α濃度，從而抑制膝骨性關節炎軟骨基質降解和關節軟骨破壞，對軟骨損傷的修復有利。

拔伸松動手法； 膝骨性關節炎； 白細胞介素1β； 腫瘤壞死因子α

骨性關節炎(Osteoarthritis, OA)的發病機制至今尚不清楚，現代醫學認為其發病與一氧化氮、骨內高壓、氧自由基、炎癥介質、關節載荷紊亂、自身免疫反應等有關。近年來，細胞因子對OA的影響已引起廣泛關注，尤其是細胞因子中的白細胞介素(interleukin 1 beta, IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)，被認為是骨關節炎病理過程中促進軟骨基質降解和關節軟骨破壞的兩種最重要的細胞因子。本研究旨在研究拔伸松動手法對以家兔下肢關節機械制動造模方法[1]制作的兔膝骨性關節炎模型關節液中的IL-1β、TNF-α的影響，從細胞分子水平方面探索拔伸松動手法治療兔膝骨性關節炎的機理，為該手法治療膝關節骨性關節炎提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年白兔40只，體重1.8～2.5 kg，雌雄不限，重量分布均一。采用隨機數字表法分為4組，即拔伸松動手法組、注射透明質酸鈉組、模型組，正常組。4組經治療和觀察6周后，拔伸松動手法組與注射透明質酸鈉組各有2只實驗兔死亡，與隨機選取的模型組與正常組各8只實驗兔進行相關指標檢測。

1.2 治療方法

拔伸松動手法組，以拔伸松動手法治療兔右膝，專人操作，手法、操作步驟及時間固定。手法為按揉法、拔伸松動法；取穴膝眼、血海、鶴頂、陽陵泉、陰陵泉、足三里、委中，家兔的取穴方法按《實驗針灸學》[2]嚴格取穴。先按揉以上所取諸穴，20秒/穴，再施以拔伸松動手法：(1) 拔伸法施以患膝10秒后放松；(2) 徐徐拔伸患膝，在拔伸下分別以小魚際固定于膝關節下緣之內側和外側，向對側推按5次(外側向內側，內側向外側)；(3) 五指提拿髕骨10次，順時針和逆時針活動髕骨5次，再上下左右推動髕骨；(4) 屈伸患膝關節30次；(5) 拔伸患膝10秒，在拔伸過程中作膝關節小幅度內旋和外旋運動。手法治療每天一次，治療十天后休息一天，共治療6周。

注射透明質酸鈉組，關節腔內注射透明質酸鈉(山東正大福瑞達公司生產，國藥準字H10960136，產品批號：2012-01-09)。規格2 ml∶20 mg，按0.15 ml/kg，每周注射1次，共治療6周。

模型組，正常組僅給飼料，喂養6周。

1.3 觀測指標

測定膝關節液中IL-1β、TNF-α含量。采用IL-1β及TNF-α試劑盒。檢測按照IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒酶標儀說明書操作。膝關節液采集施行膝關節穿刺，證實刺入關節腔后，注入0.9%的生理鹽水0.5 ml，反復回抽、注入3次后，再盡量抽出腔內液體。回收量0.4～0.6 ml，平均0.5 ml。采集的膝關節沖洗液按說明采用雙抗體夾心(ELISA)法測定。

1.4 統計學處理

2 結果

4組白兔試驗后膝關節液中IL-1β、TNF-α濃度數據詳見表1。

表1 白兔試驗后膝關節液中IL-1β、TNF-α濃度

其中各組IL-1β濃度平均數值為模型組>正常組>注射透明質酸鈉組>拔伸松動手法組，統計學上通過方差分析，F=8.833，P=0.000，P<0.05，表明四組兔膝關節液中IL-1β濃度不全相等。用LSD-t進行兩兩比較分析，得出正常組與模型組比較P=0.001，拔伸松動手法組與模型組比較P=0.000，注射透明質酸組與模型組比較P=0.001，表明拔伸松動手法組、正常組、注射透明質酸組與模型組差異皆有統計學意義。拔伸松動手法組與正常組比較P=0.289，拔伸松動手法組與注射透明質酸組比較P=0.575，正常組與注射透明質酸組比較P=0.668，表明這三組之間兩兩比較差異無統計學意義。

各組TNF-α濃度平均數值為模型組>拔伸松動手法組>注射透明質酸鈉組>正常組，統計學上通過方差分析，F=11.488，P=0.000，P<0.05，表明四組兔膝關節液中TNF-α濃度不全相等。用LSD-t進行兩兩比較分析，得出正常組與模型組比較P=0.000，拔伸松動手法組與模型組比較P=0.001，注射透明質酸組與模型組比較P=0.000，表明拔伸松動手法組、正常組、注射透明質酸組與模型組差異皆有統計學意義。拔伸松動手法組與正常組比較P=0.151，拔伸松動手法組與注射透明質酸組比較P=0.230，正常組與注射透明質酸組比較P=0.891，表明這三組之間兩兩比較差異無統計學意義。

說明通過拔伸松動手法治療和注射透明質酸鈉治療，都能降低膝關節關節液中的IL-1β、TNF-α濃度，且兩組差異沒有統計學意義。表明拔伸松動手法也是一種治療膝關節骨性關節炎的有效治療手段。

3 討論

膝關節骨性關節炎是由于關節滑膜退變，軟骨破壞引起的以膝關節疼痛、僵硬和活動受限為特征的慢性骨關節病，其中關節軟骨退變是OA發病的最直接原因，研究表明膝關節骨性關節炎的發病主要與生物力學因素、生物化學因素、遺傳因素、炎癥性因素等有關。近年來發現細胞因子IL-1β、TNF-α是參與骨關節炎進程的重要介質，是炎癥反應的重要調節劑，是調節炎癥的始動因素，是骨關節炎病理過程中促進軟骨基質降解和關節軟骨破壞的兩種最重要的細胞因子[3-4]。Hung等[5]將重組人IL-1β注入兔膝關節，發現滑膜內有大量白細胞浸潤，滑膜細胞增生，滑膜肥厚，并有關節軟骨蛋白多糖合成下降。TNF-α在關節炎(包括OA)的發生過程中對關節軟骨起著重要的破壞作用。TNF-α和IL-1的生物學作用相似，但其生物學活性比IL-1約低100倍，在OA的發病中與IL-lβ起著協同作用，動物模型研究也表明關節軟骨的破壞主要是由IL-1β激發的，并且在早期和TNF-α是密切相關的[6-7]。

中醫藥治療膝關節骨性關節炎有獨特的優勢，其中推拿手法治療本病的研究已取得可喜的進展。近年來的研究證實：手法的作用和關節被動運動可促進滑液向關節軟骨的浸透和擴散，改善組織的營養代謝，有助于改善關節周圍的血液循環，降低骨內壓，促進關節周圍組織的自身修復，改善關節軟骨的營養和關節的潤滑, 并能減輕軟骨的退變，還可增加股四頭肌之肌力，改善關節的活動度[8-9]。拔伸松動法為云南中醫學院第一附屬醫院推拿科治療膝關節骨性關節炎的經驗手法，該手法將理筋手法與關節松動手法有機結合，包括拔伸下側向推按法、髕骨松動法、拔伸下微旋法和屈伸法四步，臨床研究中發現：該手法能明顯改善膝骨性關節炎患者關節活動度，緩解疼痛[10]。課題組在前期的實驗研究中亦發現，拔伸松動法能明顯改善兔膝骨性關節模型的關節活動度，修復退變的軟骨組織[11]。

本課題將關節腔內注射透明質酸鈉設為對照組，研究結果表明：治療后拔伸松動手法組關節液中的IL-1β、TNF-α濃度與正常兔膝關節液中的濃度無顯著差異，較模型組中兔膝關節液中的濃度低；拔伸松動手法組和注射透明質酸鈉組，均能降低膝關節關節液中的IL-1β、TNF-α濃度，兩組差異沒有統計學意義。說明拔伸松動手法可能通過降低兔膝骨性關節炎關節液中的IL-1β、TNF-α濃度，達到抑制膝骨性關節炎軟骨基質降解和關節軟骨破壞的目的，對軟骨損傷的修復有利。

[1]邱貴興．兔膝關節制動引起關節軟骨退變的實驗研究[J]．中華外科雜志，1987，25(3)：175-177．

[2]余曙光，郭義．實驗針灸學[M]．上海：上海科學技術出版社，2009：154-155．

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[4]Westacott CI, Sharif M. Cytokines in ostedoarthritis: mediators or markers of joint destruction[J]. SeninArthri Rheum, 1996, 25(4): 254-272.

[5]Hung GL, Galea Lauri J, Nueller GM, et a1. Suppression of Intra-artieular responses to interleukin-l by transfer of the Interleukin-1 receptor eontagonist gene to synovium[J]. Gene Ther, 1994, 1(1): 64-69.

[6]Goldring MB. The role of cytokines as inflammatory mediators in osteoarthritis: lessons from animal models[J]. Connet Tiss Res, 1999, 40(1): 1-11.

[7]王濟維，杜寧，符詩聰，等．手法治療實驗性膝骨性關節炎研究[J]．上海第二醫科大學學報．1996，16(6)：417-419．

[8]唐旭昇，杜寧，張昊，等．手法治療大鼠實驗性膝骨性關節炎掃描電鏡研究[J]．中醫正骨，2001，13(1)：3-4．

[9]韓菎，熊昌源．“三聯療法”對兔膝關節骨關節炎氧自由基代謝的影響[J]．湖北中醫雜志，2006，28(3)：9-10．

[10]王春林，趙永康，趙志勇，等．拔伸松動法治療膝關節骨性關節炎的臨床觀察[J]．按摩與康復醫學，2011，5(2)：23-25．

[11]王春林，向勇，田啟東，等．拔伸松動法治療兔膝骨性關節炎的實驗研究[J]．云南中醫中藥雜志，2010，31(9)：14-16．

(本文編輯：黃凡)

InfluenceonIL-1β,andTNF-αinthekneesofrabbitswithosteoarthritisbymassagemanipulationofstretch-pull-loose

WANGChun-lin,XIANGDong,TIANQi-dong,etal.

Thedepartmentofmassage,theFirstAffiliatedHospitalofYunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming650021,China

WANGChun-lin,E-mail: 2478026881@qq.com

ObjectiveTo study the influence on interleukin 1 beta (IL-1β) tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in the knees of rabbits with osteoarthritis by massage manipulation of stretch-pull-loose.MethodsRabbits are randomly divided into four groups-stretch-pull-loose manipulation group (SMG), the sodium hyaluronate injected group (SHG), the model group (MG) and the normal group (NG). Rabbits from SMG

the manipulation of stretch-pull-loose, once daily with a day of break every ten days, for 6 weeks. Rabbits from SHG received sodium hyaluronate injection, once weekly, for 6 weeks. Rabbits from MG and NG were given regular chow.ResultsAfter the intervention, the average level of IL-1β in joint fluid showed MG> NG > SHG> SMG; and the average level of IL-1β in joint fluid exhibited MG>SMG>SHG>NG. Pairwise comparison among each group was drawn with the method of variance analysis and LSD - t, which. shows the two parameters observed in SMG, SHG and MG were statistically different from those in NG (P<0.05)., Further, they were observed to be with no statistically significant differences among SMG, SHG and MG.ConclusionBoth stretch-pull-loose manipulation and sodium hyaluronate intervention serve to reduce the level of IL-1β and TNF-α in the knees of rabbits with osteoarthritis, while no difference can be observed between the two therapies.The mechanism of stretch-pull-loose manipulation’s effectiveness in repairing cartilage injuries in osteoarthritis, as is speculated, is by lowering the level of IL-1β and TNF-α in knees, which inhibit the degradation of cartilage and the destruction of bone matrix.

Stretch-pull-loose manipulation； Knee of rabbits with osteoarthritis； IL-1β； TNF-α

云南省自然科學基金(2009ZC152M)

650021 昆明，云南中醫學院第一附屬醫院推拿科(王春林、向勇、田啟東、胡鸞、趙志勇、董有康、趙永康)，檢驗科(林云)；云南中醫學院針灸推拿康復學院推拿臨床教研室(邵長麗)

王春林(1968- )，本科，教授，主任醫師。研究方向：脊柱推拿、膝關節骨性關節炎的中醫藥治療。E-mail: 2478026881@qq.com

R244.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.02.002

2013-08-02)