假龍膽總多酚含量測定及抗氧化活性研究

宋海龍 朱國強(qiáng) 盧曉麗 田樹革 賈曉光

·論著·

假龍膽總多酚含量測定及抗氧化活性研究

宋海龍 朱國強(qiáng) 盧曉麗 田樹革 賈曉光

目的建立假龍膽總多酚含量的測定方法。方法采用可見分光光度法測定假龍膽中總多酚的含量，并建立清除羥基自由基和超氧陰離子自由基兩種抗氧化模型對假龍膽抗氧化能力進(jìn)行評價。結(jié)果以沒食子酸作為測定總多酚含量的對照品，在濃度0.05～0.3 mg (r=0.9999)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果表明，總多酚含量平均值為7.63 mg，假龍膽提取液具有良好的抗氧化能力。結(jié)論此方法操作簡便，重現(xiàn)性良好、穩(wěn)定，可作為假龍膽總多酚的檢測方法，并可作為天然抗氧化劑資源進(jìn)行開發(fā)研究。

假龍膽；總多酚；抗氧化

假龍膽屬Gentianella屬于龍膽科，根據(jù)多方面的研究結(jié)果，假龍膽屬為一單系屬，全球約有125種，中國有9種，主要分布于東北、西北及西南部[1]。新疆假龍膽Gentianellaturkestanorum為1年或2年生草本植物，全草入藥[2-4]。本文對新疆假龍膽的總多酚及抗氧化能力進(jìn)行測定，為假龍膽檢測提供新的方法依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Spectrumlab 22可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司制造)；KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AL204電子天平(梅特勒—托利多儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

藥材：假龍膽(產(chǎn)地：新疆奇臺縣興場大東溝；經(jīng)緯度：E89°53′ N43°35′ 高度：1659.8 m)藥材粉碎，過40目篩，即得。

試劑：維生素C(vitamin C，Vc)三羥基甲基氨基甲烷、冰醋酸、香草醛、碳酸鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、雙氧水、無水乙醇、甲醇均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。沒食子酸對照品(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，含量：99%)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試劑的制備

福林酚試劑的制備：稱取鎢酸鈉50 g，鉬酸鈉12.5 g，用350 ml蒸餾水溶解于圓底燒瓶中，加入25 ml磷酸(≥85%)和50 ml濃鹽酸充分混勻，小火加熱回流12小時，放冷，再加入75 g硫酸鋰、25 ml蒸餾水及0.1ml雙氧水，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，使得雙氧水完全揮發(fā)，冷卻后用蒸餾水定容至500 ml，過濾，于棕色瓶中避光儲存。試液應(yīng)呈亮黃色，如放置后變?yōu)榫G色，可加雙氧水0.2 ml，煮沸15分鐘即可[5-7]。

對照品溶液液的制備：精密稱取5.0001 mg沒食子酸化學(xué)對照品于100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容，制成濃度為0.05 mg/ml總多酚對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

稱取假龍膽藥材1 g，加入65%的乙醇25 ml超聲處理30分鐘，離心，將上清液定容至100 ml，即得。

2.3 最佳測量波長的選擇

準(zhǔn)確吸取1.5 ml總多酚對照儲備液于25 ml容量瓶中，分別加入18.0 ml蒸餾水、福林試劑1 ml，用15%Na2CO3溶液定容，于30℃水浴中恒溫反應(yīng)1.5小時。以蒸餾水為空白對照，在650～800 nm波長下掃描其吸光度，結(jié)果表明沒食子酸在758 nm處有強(qiáng)吸收峰，故選擇758 nm作為總多酚的測定波長。

2.4 清除羥基自由基能力

2.5 清除超氧陰離子能力

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取總多酚對照品溶液1 ml 、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml于10 ml容量瓶中蒸餾水定容，分別取上述溶液各3 ml加3 ml水，然后加0.5 ml福林酚試劑，最后加1.5 ml的20%碳酸鈉溶液混勻，加水定容，75℃加熱10分鐘，758 nm波長下測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，測定得吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程Y=0.2034X+ 0.0502，r=0.9999，線性范圍0.005～0.03 mg/ml。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份總多酚供試品溶液3 ml，加入蒸餾水3 ml，分別于0分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘按照“3.1”方法顯色后測定吸光度值，計算得到假龍膽總多酚含量的RSD為1.05%，樣品在60分鐘內(nèi)顯色穩(wěn)定。

3.2.2 精密度試驗(yàn) 取6份總多酚對照品溶液，每份3 ml，按照“3.1”方法顯色后測定吸光度值，計算得到薰衣草總多酚含量的RSD為1.58%，說明該方法測定假龍膽總多酚含量精密度良好。

3.2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批假龍膽樣品6份，分別按照“2.2”方法制成總多酚供試品溶液，每份精密吸取3 ml，按照“3.1”方法顯色后測定吸光度值，計算得到RSD為2.88%，表明該方法測定假龍膽總多酚含量重現(xiàn)性良好。

3.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知濃度的總多酚供試品溶液9份分成3組，每份1.5 ml，分別精密加入高、中、低不同濃度的總多酚對照品溶液適量，按照“3.1”方法顯色后測定吸光度值，并計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 假龍膽中總多酚的回收率

3.3 樣品含量測定

取假龍膽三份，每份平行3個樣品，按照“2.2”方法制成總多酚樣品溶液，每份精密吸取3 ml，按照“3.1”方法顯色后測定吸光度值，結(jié)果如表2。

表2 假龍膽中總多酚含量(n=3)

3.4 對羥基自由基的清除能力

由圖1分析可知，假龍膽提取液和陽性對照Vc對羥基自由基的清除作用均隨著濃度的增大而增加。當(dāng)濃度為40 μg/ml時，假龍膽提取液對羥基自由基的清除作用是Vc對羥基自由基的清除作用的2.97倍；當(dāng)濃度為400 μg/ml時，假龍膽提取液對羥基自由基的清除作用是Vc對羥基自由基的清除作用的1.13倍。假龍膽提取液對羥基自由基的清除作用整體大于Vc對羥基自由基的清除作用。

圖1 對羥基自由基的清除能力

3.5 對超氧陰離子的清除能力

由圖2分析可知，假龍膽提取液和陽性對照Vc對超氧陰離子的清除作用均隨著濃度的增大而增加。當(dāng)濃度為40 μg/ml時，Vc對超氧陰離子的清除作用比假龍膽提取液對超氧陰離子的清除作用小；當(dāng)濃度為400 μg/ml時，Vc對超氧陰離子的清除作用是假龍膽提取液對超氧陰離子的清除作用的1.66倍。在40～400 μg/ml濃度范圍內(nèi)，假龍膽提取液對超氧陰離子的清除率增長趨勢較為平緩，而Vc對超氧陰離子的清除作用增長趨勢較大。

圖2 對超氧陰離子的清除能力

4 結(jié)論

從研究結(jié)果可以看出，假龍膽中具有較為豐富的總多酚，采用可見分光光度法測定假龍膽總多酚含量，簡單易行，重現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可作為測定假龍膽藥材總多酚含量的檢測方法。對假龍膽抗氧化作用研究發(fā)現(xiàn)，假龍膽提取液具有一定的抗氧化能力，可作為天然抗氧化資源進(jìn)行開發(fā)。

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(本文編輯： 董歷華)

Gentianellaturkestanorum(Gand.)Holub.totalpolyphenolcontentandantioxidantactivitydetermination

SONGHai-long，ZHUGuo-qiang，LUXiao-li，etal.

XinjiangInstituteofChineseMateriaMedicaandEthicalMateriaMedica，Urumqi830002，China

JIAXiao-guang，E-mail：xgjia@vip.sina.com.cn

ObjectiveTo establish a method for the determination of total Polyphenol inGentianellaturkestanorum(Gand.) Holub.MethodsThe total Polypheno land in Gentianaceae was determined by visible spectrophotometry，and establish two kinds of anti-oxidation model-scavenging hydroxyl radicals and scavenging superoxide anion radicals-to evaluate Gentianella turkestanorum (Gand.) Holub. in its antioxidant ability.ResultsThe method had a good linearity in the range of 0.05～0.3 mg(r=0.9999)with gallic acid as the reference substance. The results showed that an average total polyphenol content of 7.63 mg，Gentianellaturkestanorum(Gand.) Holub. extracts had good oxidation resistance.ConclusionsThis method was simple，with good reproducibility，and stability， and could be adopted as the standard method for detectingGentianellaturkestanorum(Gand.) Holub. total polyphenols.Gentianellaturkestanorum(Gand.) Holub , as a natural anti-oxidant resources, is worth further research and development.

Gentianellaturkestanorum(Gand.) Holub.； Total Polyphenol； Antioxidant activity

新疆維吾爾藥與特色天然藥物創(chuàng)制及產(chǎn)業(yè)化示范項目(201130105-1)；重大公共衛(wèi)生專項——全國第四次中藥資源普查新疆(試點(diǎn))項目(2100409)

830001 烏魯木齊，新疆中藥民族藥研究所科教科[宋海龍(碩士研究生)、朱國強(qiáng)、賈曉光)]；新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥系[盧曉麗(碩士研究生)、田樹革)]

宋海龍(1973- )，2102級在職碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師。研究方向：食品加工與安全。E-mail：xjwssong@126.com

賈曉光(1955- )，碩士，主任藥師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥資源與化學(xué)。E-mail：xgjia@vip.sina.com.cn

R284.2

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.02.007

2013-11-20)