HPLC法測定苯扎貝特酰化物中的有關物質

黃東  吳保祥  王昉

[摘要] 目的 建立苯扎貝特酰化物中有關物質的測定方法。 方法 NUCLEOSIL 100-5 C18（5μm）0.125m×4mm；流動相為磷酸二氫鉀溶液（2.72g/L，用磷酸調節pH2.3）︰甲醇=4︰6；檢測波長：228nm；流速：1.0mL/min。 結果 苯扎貝特酰化物與主要雜質能得到有效分離，各雜質在0.2~3.5μg/mL范圍內呈良好線性關系。 結論 本測定方法靈敏度高，準確可靠，可以控制苯扎貝特酰化物中有關物質的含量。

[關鍵詞] 苯扎貝特酰化物；有關物質；系統適用性

[中圖分類號] R927.2???[文獻標識碼] B???[文章編號] 2095-0616（2014）09-118-04

Related substances determination of bezafibrate acylate by HPLC

HUANG?Dong1??WU?Baoxiang1??WANG?Fang2

1.Jiangsu Tasly Diyi Pharmaceutical CO., Ltd.， Huaian 223002, China; 2.Analytical＆Testing Center of Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China

[Abstract] Objective To establish an HPLC method for detection of the related substances. Methods The analytical column was NUCLEOSIL 100-5 C18 column (4.0mm×12.5cm, 5μm). The mobile phase was potassium dihydrogen phosphate (2.72g/L, adjust to pH 2.3 with phosphoric acid): methanol = 4:6 The flow rate was 1.0mL/min. The wavelenth was 228nm. Results A satisfactory separation condition for the five related impurities, the impurities standard curve was good linear over the range of 0.2-3.5μg/mL. Conclusion The method is sensitive and accurate and it can be used to determine the relateted substances of bezafibrate acylate.

[Key words] Bezafibrate acylate; Related substances; System suitability

苯扎貝特酰化物化學名N-對羥基苯乙基-4-氯苯甲酰胺，是合成降脂藥苯扎貝特的重要中間體，目前它的合成主要以酪氨（對羥基苯乙胺)鹽酸鹽為原料，與對氯苯甲酰氯發生酰化反應后先生成中間體，不經分離與甲醇發生酯交換反應而得，再經縮合反應制得苯扎貝特，所以苯扎貝特酰化物的質量優劣直接關系到苯扎貝特產品的質量，在苯扎貝特酰化物的生產過程中，實際存在和可能產生的雜質有對羥基苯乙胺、4-氯-苯甲酸及一些未知雜質等。本文通過對苯扎貝特酰化物生產過程的監控，來確定其質量的優劣，為下一步苯扎貝特的生產提供有力的保證。

苯扎貝特酰化物原有的質量標準中只有性狀、熔點、干燥失重、含量等項目，不能完全反應出其真正的質量，本文通過建立高效液相色譜法來測定其有關物質，來更好地控制苯扎貝特酰化物的質量，參考文獻方法，本文采用高效液相色譜法建立了苯扎貝特酰化物中有關物質的分析方法，并對該方法的專屬性、精密度、線性、回收率、檢測限和定量限等進行了驗證，均滿足要求，方法可行。

1?儀器設備與試劑試藥

高效液相色譜儀HPLC系統：沃特斯高效液相色譜儀2489檢測器，2695分離單元（四元泵、717自動進樣器、柱溫箱）；軟件：Empower3.工作站；HP1020打印機。

苯扎貝特酰化物標準品（lot：101169-201001）；甲醇（色譜純201308066，江蘇漢邦科技)；雜質對羥基苯乙胺lot：20131016，含量：99.8%)；雜質4-氯-苯甲酸（lot：130112，含量：100%阿拉丁化學試劑有限公司）。

2?方法與結果

2.1?色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 C18（5μm）12.5cm×4mm。流速為1.0mL/min ；檢測波長為228nm。流動相：磷酸二氫鉀溶液（2.72g/L，用磷酸調節pH2.3）︰甲醇=400︰600； 進樣量：20.0μL。

2.2?溶液制備

試驗溶液：取本品50.0mg加流動相溶解稀釋至100.0mL。

對照溶液（1）：吸取試驗溶液10.0mL加流動相稀釋至100.0mL，再吸上述溶液10.0mL加流動相稀釋至100.0mL。

對照溶液（2）：吸取對照溶液（1）5.0mL加流動相稀釋至50.0mL。

對照溶液（3）：取4-氯苯甲酸（雜質B）對照品2mg加流動相適量使溶解，加入2mL試驗溶液用流動相稀釋至50mL。

2.3?進樣操作與系統適應性試驗

系統平衡后，按照以上的色譜條件，在記錄對照溶液（3）的色譜圖中，兩主峰分離度在1.5以上，在記錄對照溶液（2）的色譜圖中采用信噪比至少為5。

空白測試：取稀釋溶劑進樣，作為空白，表明稀釋溶劑對雜質測定無干擾，在樣品測定中出現溶劑峰的應忽略。

分別取20μL試驗溶液和20μL對照溶液（1）、（2）、（3）注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的2倍。

2.4?計算公式

總雜質含量（%)＝

式中：WS→配制對照液（a)的樣品的重量，mg；

Wi→樣品的重量，mg；

As→對照液（a)中主峰的峰面積。

→供試液色譜圖中總雜質的峰面積。

2.5?結果判定

記錄試驗溶液的色譜圖中，除主峰外，其他峰面積不得大于對照溶液（1）的主峰面積（1.0%）。除主峰外，所有峰面積的總和，不得大于對照溶液（1）的主峰面積的2倍（2.0%），小于對照溶液（1）的主峰面積的0.05倍的峰不記錄。

2.6?方法的專屬性

2.6.1?雜質及苯扎貝特酰化物的分子結構確認（委托南京師范大學分析中心檢測)?通過紫外分光光度計、液相色譜-質譜、紅外分光光度計等方法進行結構解析確證各雜質的分子結構[1-6]。

2.6.2?單個雜質的定性?依次取雜質對羥基苯乙胺（lot：20131016，含量：99.8%)10mg，至一個25mL容量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，混合均勻。進樣，記錄色譜圖，用保留時間對對羥基苯乙胺進行定性，雜質4-氯-苯甲酸（lot：130112，含量：100%阿拉丁化學試劑有限公司）10mg，至一個50mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，混合均勻，進樣，記錄色譜圖，用保留時間對4-氯-苯甲酸進行定性，取苯扎貝特酰化物對照品（lot：101169-201001）10mg至一個25mL容量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，混合均勻。進樣，記錄色譜圖，用保留時間對苯扎貝特酰化物進行定性。然后分別取上述三種溶液各5mL至50mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，進樣記錄色譜圖，各雜質的分離度和理論板數都符合規定，見圖1。

2.6.3?高溫破壞性試驗?精密稱取樣品細粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分別進行80℃高溫烘箱中加熱1、3、5、10d進行破壞性試驗，用溶劑溶解稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.4?光照破壞性試驗?精密稱取樣品細粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，在4500L X光照下照射1、3、5、10d用溶劑溶解稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.5?酸破壞性試驗?精密稱取樣品細粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分別加入1.0mol/L鹽酸的1mL在100℃水浴中加熱1、2、3、5h進行破壞性試驗，再用1.0mol/L的氫氧化鈉中和，再用溶劑稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.6?堿破壞性試驗?精密稱取樣品細粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分別加入1.0mol/L的氫氧化鈉1mL在100℃水浴中加熱1、2、3、5h進行破壞性試驗，再用1.0mol/L的鹽酸中和，再用溶劑稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.7?氧化破壞性試驗?精密稱取樣品細粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分別加入30%雙氧水1mL在100℃水浴中加熱1、2、3、5h進

圖1??分離度色譜圖

行破壞性試驗，再用溶劑稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

分別取上述溶液進樣，記錄色譜圖，結果表明苯扎貝特酰化物經，高溫、光照、酸、堿、氧化等破壞性試驗所降解產生的雜質與主成分份均能有效分離，經對主成分峰的峰純度分析，峰純度均符合要求，表明該方法具有良好的專屬性。

2.7?精密度和重復性

分別精密稱取苯扎貝特酰化物10mg、對羥基苯乙胺10mg、4-氯苯甲酸10mg，與同一50mL容量瓶中，用溶劑稀釋溶解并定容至刻度，在上述色譜條件下連續進樣6次，記錄色譜圖，苯扎貝特酰化物的峰面積的RSD為1.1%，對羥基苯乙胺峰面積的RSD為0.9%，4-氯苯甲酸峰面積的RSD為1.3%，均小于2.0%。重復性和中間精密度符合規定。

2.8?雜質線性回歸試驗

標準貯備液：分別精密稱取以下標準品：雜質對羥基苯乙胺、雜質4-氯-苯甲酸10.0mg，各至一個500mL容量瓶中，各加入流動相超聲溶解并稀釋至刻度，混合均勻，得到每個雜質的標準貯備液。每個雜質的濃度均約為20.0μg/mL。

分別取標準貯備溶液0.5，1.0，2.5，4，5，6，10mL分別至7個50.0mL容量瓶，用流動相稀釋至刻度，制成濃度分別為0.2、0.4、1、1.6、2、2.4、4μg/mL的一系列溶液，搖勻，各精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各組分峰面積平均值對其濃度（μg/mL），進行線性回歸分析，得到各組分的標準曲線。對羥基苯乙胺、4-氯-苯甲酸線性回歸相關系數r分別為0.9995、0.9998均大于0.999，結果表明對羥基苯乙胺、4-氯-苯甲酸在濃度0.2~0.32ug/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.9?加樣回收試驗

精密稱取已測定有關物質含量的樣品適量，共3份，分別置50mL容量瓶中，加適量溶劑溶解，然后各精密加入已知濃度的對羥基苯乙胺，4-氯苯甲酸對照品的貯備液，制成相當于雜質80%、100%、120%的溶液并稀釋至刻度，搖勻，按2.1項下色譜條件，進樣，記錄色譜圖，計算對羥基苯乙胺、4-氯苯甲酸的含量，減去樣品本底具有的含量，計算回收率，結果對羥基苯乙胺的平均回收率為： 99.2%，RSD=0.69%（n=9）；4-氯苯甲酸為100.1%， RSD=0.92% （n=9)。

2.10?雜質檢測限的測定

在2.1色譜系統下進樣，記錄色譜圖。當對羥基苯乙胺進樣濃度為0.01μg/mL時，其色譜峰高約為基線噪音的3倍，當4-氯苯甲酸進樣濃度為0.02μg/mL時，其色譜峰高約為基線噪音的3倍，當苯扎貝特酰化物進樣濃度為0.005μg/mL時，其色譜峰高約為基線噪音的3倍，根據進樣量20μL計算，對應的對羥基苯乙胺檢測限為1ng，4-氯苯甲酸檢測限為2ng，苯扎貝特酰化物檢測限為0.5ng。

2.11?樣品的穩定性

取同一供試品溶液分別于配制后0、2、4、8h內按“ 2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積，結果苯扎貝特酰化物的峰面積RSD為0.8%，對羥基苯乙胺的峰面積RSD為1.1%，4-氯苯甲酸的峰面積RSD為1.0%，表明溶液在8h內穩定。

2.12?樣品有關物質測定

樣品中有關物質測定結果見表1。

表1??樣品中有關物質測定結果（%）

名稱 批號

BZ1306001a BZ1306002a BZ1306003a

對羥基苯乙胺 0.05 0.08 0.10

4-氯苯甲酸 0.21 0.30 0.28

單個最大未知雜質 0.02 0.01 0.02

總雜質 0.50 0.56 0.53

取樣品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖至主成分保留時間的2.5倍。按面積歸一化法計算單一雜質及總雜質的含量，苯扎貝特酰化物樣品雜質含量測定結果均符合標準規定[7]。

3?討論

本實驗考慮到后期成品的質量檢測，且這幾種物質在228nm處均有較大吸收，所以采用苯扎貝特成品的有關物質色譜條件來進行[8]。

溶劑的選用，考慮到苯扎貝特酰化物在流動相中也具有一定的溶解度，對于有關物質檢查樣品的濃度可以滿足要求，所以選擇流動相做為溶劑，也避免了其他溶劑對雜質的干擾[9-10]。

本實驗采用高效液相色譜法法來檢查苯扎貝特酰化物的有關物質，通過實驗可以看到，本方法對雜質與主成分苯扎貝特酰化物能較好的分離，該方法簡單易行并且具有良好的專屬性[11-12]。

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（收稿日期：2014-03-12）