非小細胞肺癌與EML4-ALK融合基因的關系及其檢測方法

高杰  韋立新

[摘要] 目前，肺癌已經成為世界范圍內發病率及死亡率最高的腫瘤之一。隨著分子生物學研究的飛速進展，肺癌的內科治療已經從傳統的化療、放療發展為個性化的靶向治療。針對多種靶基因突變的靶向治療為肺癌患者延長生命、提高生活質量帶來希望。此文就最新的非小細胞肺癌靶基因EML4-ALK相關問題進行綜述。

[關鍵詞] 肺癌；個性化治療；基因；EML4-ALK融合基因；表皮生長因子受體

[中圖分類號] R734.2???[文獻標識碼] A???[文章編號] 2095-0616（2014）09-40-06

Review of the study of EML4-ALK fusion protein of non-small cell lung cancer

GAO?Jie??WEI?Lixin

Department of Pathology, the General Hospital of PLA, Beijing 100853, China

[Abstract] Today, lung cancer is the most commonly diagnosed cancer and the leading causes of tumor-related deaths in the world. Along with the fast progress of molecular biology, the traditional treatment methods, chemotherapy and radiotherapy gradually have been development to individual therapy. Strategies to maximize treatment benefit have centered on individualizing treatment according to the molecular profile of the non-small cell lung cancer. This review describes the relative information of the newest oncogenic drivers, EML4-ALK fusion protein, have also been implicated as in the pathogenesis of the non-small cell lung cancer.

[Key words] Lung cancer; Individual therapy; Gene; EML4-ALK fusion protein; EGFR

目前，肺癌已經成為發病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一。肺癌可以根據治療手段的不同分為兩大類：小細胞肺癌及非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌（NSCLC）的發病率所占比重高，約為60%~85%[1]。所以近些年有關非小細胞肺癌治療方面的研究成為熱點。自2000年以來，隨著生物工程技術以及臨床藥理學的飛速發展，肺癌的治療不再局限于手術治療及干擾細胞生長周期的傳統放化療。某些特異性靶點的出現，使腫瘤的治療進入到一個特異性高、不良反應輕的靶向治療階段，使越來越多的肺癌患者受益[2]。如近幾年來，針對非小細胞肺癌重要靶點之一的EGFR基因突變而設計的EGFR酪氨酸激酶抑制劑的出現（tyrosine kinase inhibitors，TKI），如吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）等可以通過對腫瘤細胞EGFR的特異性結合阻斷細胞信號傳導通路，從而達到抑制腫瘤細胞的增殖并促進其凋亡達到治療目的[3]。然而，并非所有的NSCLC患者對于TKI的治療表現出較好的療效[4]。隨著肺癌腫瘤分子生物學研究的深入，逐漸發現NSCLC患者中存在與EGFR突變及K-RAS突變不重疊的另外一個重要的酪氨酸激酶抑制劑的作用靶點——EML4-ALK融合基因[5]。此融合基因在NSCLC陽性表達的患者中可能受益于ALK抑制劑的治療。本文中，我們將簡要探討非小細胞肺癌中EML4-ALK融合基因的分子基礎及其各種檢測方法的不同。

1?ALK抑制劑治療的分子基礎

ALK基因重排是于1994年首先在間變大細胞淋巴瘤（ALCL）AMS3細胞株中被發現的[6]，該基因是由1620個氨基酸組成的一種跨膜蛋白，它編碼一種有結構性激酶活性的細胞質嵌合蛋白，屬于胰島素受體家族成員之一。之后該基因在炎性肌纖維母細胞瘤、神經母細胞瘤等腫瘤中陸續被發現。

直到2007年，日本學者Soda發現該融合基因與肺癌的關系，其在一位吸煙的肺癌患者的腫瘤組織內檢測到了棘皮動物微管相關蛋白樣4和間變性淋巴瘤激酶基因（EML4-ALK）發生基因融合而成的具有致瘤性的變異基因[7]。對NSCLC患者進行該融合基因表達情況的檢測，同時經細胞實驗證實ALK抑制劑可以通過濃度依賴的方式抑制轉染該基因的BA/F3細胞生長，從而誘發凋亡的發生。這不僅證實了ALK變異基因對肺癌腫瘤細胞增殖中所起到的作用，也充分的支持其作為一種藥物靶點的有效性[8]。

EML4-ALK融合基因的產生源于染色體的重排，發生部位在2號染色體短臂上。EML4由N'末端堿基區、疏松的棘皮動物微管相關蛋白樣區（hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein，HELP）及WD重復區三部分組成，屬于棘皮動物微管相關蛋白樣家族成員。在EML4-ALK融合基因中，EML4的N'末端堿基區、HELP及WD重復區與ALK的胞內近胞膜部位發生融合[9]。正常情況下，棘皮動物微管相關蛋白樣4和間變性淋巴瘤激酶基因分別位于染色體的2p21-2p23兩端；當基因重排時ALK基因和EML4基因在2號染色體N'末端發生倒位，產生了包含酪氨酸激酶（TK）活性的癌蛋白嵌合體，此改變是肺癌中最常見的ALK基因異常。目前，已經發現有27種EML4-ALK的融合變型體存在，21種變型體位于EML4端，因為EML4斷裂可以存在于多個不同的外顯子上（如2，6，13，14，15，17，18和20等）。在所有變型體中，ALK基因的TK區域均位于20號外顯子。最常見的融合基因變型體為發生于EML4基因端的外顯子1和3a/b。在肺非小細胞癌中，除了EML4-ALK融合基因外，還存在一些罕見的ALK融合情況被發現，如ALK與驅動蛋白家族成員5B基因（kinesin family member 5B， KIF5B）和原肌凝蛋白受體激酶融合基因（tropomyosin receptor kinase-fused gene， TFG）發生融合的情況。因此，ALK基因重排可能定義為一種對靶向激酶抑制敏感的腫瘤分子亞組。

另外，由于EML4-ALK融合基因與KRAS基因突變比較相似，又與EGFR突變不共同存在，因此有學者推測EML4-ALK融合基因的存在可能解釋為又一個潛在的原發耐藥機制。Shaw等發現在輕度或不吸煙且無EGFR突變的非小細胞肺癌患者中，約33%的患者EML4-ALK融合基因為陽性[10]。同時，他們還對53例非小細胞肺癌患者進行EGFR-TKI治療，19例患者療效顯著，其中未檢出EML4-ALK基因陽性，而在34例EGFR-TKI耐藥者中檢測出該融合基因檢出率高達29%。另外，Koivunen[11]等發現厄洛替尼不能抑制EML4-ALK陽性的非小細胞肺癌細胞株H3122增殖。由此可以假設，EML4-ALK融合基因可能是EGFR-TKI原發性耐藥的重要原因之一。

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2?克唑替尼的治療

克唑替尼是一種口服小分子的ALK和c-MET酪氨酸激酶的共同抑制劑，可以抑制激活的ALK酪氨酸磷酸化。適用于非小細胞肺癌患者腫瘤組織內ALK基因檢測陽性的患者。在一期臨床研究中[12]，最初設計為包含MET基因擴增的腫瘤的擴大研究，此階段研究顯示具有顯著的抗腫瘤活性，約為61%的患者獲得客觀有效性，中位PFS值為9.7個月。在二期臨床研究中也獲得了較為驚人的結果，由910名ALK陽性的非小細胞肺癌患者入組，這些患者之前至少接受過一個療程化療后再接受克唑替尼的治療。這組患者總反應率達到了59.8%，中位PFS為8.1個月[13]。三期臨床研究對比了克唑替尼和二線化療藥的情況。有347名ALK陽性患者入組觀察，與化療組對比克唑替尼治療者有有利的PFS值（7.7個月），化療組僅為3.0個月。2010年ASCO會議上報到早期臨床試驗針對EML4-ALK融和基因的藥物PF-02341066對陽性人群有效率超過64%[14]?？诉蛱婺崴坪蹙哂泻懿畹难X屏障通透性，但臨床試驗中對于非小細胞肺癌晚期發生腦部轉移的部分患者似乎可以受益。該藥不僅具有令人肯定的療效，同時還有較好的耐受性，有報道的相關副作用包括：惡心（46%），視力損傷（45%），嘔吐（39%），和腹瀉（29%），多數為1和2級的不良事件， 3到4級不良事件患者僅為15%（多數為丙氨酸氨基轉移酶升高，呼吸困難，中性粒細胞減少癥等）[15]?；诹己玫呐R床試驗結果及患者良好的耐受性，加快了克唑替尼應用于臨床的步伐。繼FDA批準克唑替尼作為治療非小細胞肺癌ALK融合基因陽性的患者之后，我國于2013年初，中國食品藥品總局（CFDA）也批準了該藥用于臨床。

隨著治療的深入，發現小于10%的ALK陽性患者應用該藥仍然表現為疾病進程的進展，或者一些患者對治療無任何反應或僅開始有反應。因此發現，克唑替尼與其他酪氨酸激酶抑制劑一樣，即使在治療有效的患者也會出現耐藥性。新英格蘭雜志發表一篇文章，該文獻報道了1例對克唑替尼產生耐藥的NSCLC患者，其腫瘤標本中發現了兩種新發突變，可能與克唑替尼耐藥有關[16]。患者為年輕不吸煙、Ⅳ期的腺癌患者，EGFR突變檢測為陰性。于其癌細胞內檢測出EML4-AlK融合基因存在，并接受克唑替尼治療有效，治療后5個月出現腫瘤進展。對其進行DNA測序和EML4-ALK突變體檢測。發現兩處堿基（堿基4374G-A和4493C-A）改變導致該位點氨基酸（分別為C1156Y，L1196M）改變，同時進行細胞學試驗和磷酸化檢測驗證了該突變確實可導致耐藥的出現。ALK與ATP或ALK抑制劑的結合程度與兩處突變在ALK基因蛋白空間構象上所處的位置有著重要的關系[17]。除了ALK激酶域的突變外，耐藥性的幾個機制還可能解釋為ALK基因重排的拷貝增加或者是EGFR/KRAS基因突變等。

臨床病理特點：最近研究顯示，EML4-ALK融合基因存在于大約3%~7%的非小細胞肺癌患者。臨床特點為傾向于腺癌（特別是實性、印戒細胞和黏液篩狀型）、不吸煙或輕度吸煙，年輕人的患者。但此基因的融合也見于老年有吸煙史的患者[18]。

有關非小細胞肺癌ALK融合基因檢測的研究陸續見到報道，發生率約為5%（0.5%~7.5%）。不同實驗室結果也略為不同。來自我國第一份研究顯示，在肺腺癌該融合基因的檢出率為16.13%，而非吸煙患者略高，為19.23%。而EGFR、K-RAS、HER2基因未發生突變的NSCLC中，ALK融合基因陽性檢出率可高達25%[19]。在我國大陸及臺灣地區K-RAS及EGFR均為野生型的腺癌中ALK檢出比例可高達42.8%。組織學為實性、印戒細胞和黏液篩狀型腺癌中ALK的發生率遠遠高于其他類型腺癌（分別為46.2%，8%）。

因此有些學者建議在具有ALK病理學特征的，并且已經明確EGFR和K-RAS分子檢測為野生型的非小細胞肺癌患者中開展ALK檢測會大大提高檢測的陽性比率，此舉利于臨床工作的開展。但實際研究發現在一些非腺癌患者中，如腺鱗癌、鱗癌以及EGFR和K-RAS突變型的肺癌中也可以檢測出ALK陽性[20]。對于富集人群開展常規ALK的分子檢測是必需的。但僅憑這些臨床病理學特點遠遠不能完全反映全部情況，所以廣泛開展ALK篩查是非常必要的。

3?檢測方法學

對非小細胞肺癌患者腫瘤組織內ALK融合基因進行檢測， 目前有3種不同的方法分別為：FISH法（fluorescence in situ hybridization，FISH），基于PCR法（包括RACE-PCR，qRT-PCR或特異性RT-PCR）及免疫組織化學方法。由于腫瘤患者的組織來源類型不同，有時需要以標本類型選擇不同的方法進行檢測，而上述三種方法檢測原理以及各自存在不同的優缺點，所以當懷疑一種技術的可靠性時，可以考慮用另外一種方法進行驗證。下面就對這三種方法進行一一介紹。

FISH檢測：此方法為最早被FDA認證的克唑替尼（Crizotinib）處方使用推薦的檢測方法，推薦使用雅培公司Vysis ALK斷裂部分FISH探針試劑盒（Abbott Molecular，Inc）來進行非小細胞肺癌患者腫瘤組織中ALK融合基因檢測[21]。大部分克唑替尼治療的ALK融合基因陽性的非小細胞肺癌的臨床實驗均是依據FISH檢測的結果。因此，FISH檢測仍是ALK基因檢測的參照標準方法。此方法學的顯色原理：由于ALK和EML分別位于2號染色體的3'和5'兩端位置，分別在300kb3'端和442kb的5'端用標記的兩個探針（分別為橘紅色和綠色）進行標記。當未發生倒位時二者都應位于ALK基因側，因此紅色與綠色信號彼此緊鄰。當EML4-ALK融合基因存在時，由于具有ALK激酶區域的EML的N'末端發生倒位，產生了包含酪氨酸激酶（TK）活性的癌蛋白嵌合體。這個結果導致了橘紅色和綠色探針的距離拉遠。

為保證檢出的可靠性，組織的前期處理尤為重要。FISH檢測法腫瘤組織前期處理的具體要求：活檢或者切除標本需要用10%中性福爾馬林固定充分，一般固定時間要求為6~24h。包埋組織塊的大小要求不超過2cm寬，3mm厚。處理過程要求符合標準。最好切成3~5μm厚度的切片，用涂膠片可以避免裂縫假象及避免洗掉。需要在60℃微波爐內烤片1h，或在45℃保溫箱內過夜。石蠟組織塊最好為1~6個月之內的，這樣RNA降解較少，可以很好地避免雜交失敗，以避免假陰性和假陽性結果的出現。標本的適度脫蠟是避免組織切片染色出現背景或不均勻等問題的關鍵。組織消化時間多少需要在在工作中進行實際調整。當細胞成分少于50%的細胞學標本，對腫瘤細胞的進行顯微切割是非常必要的。最少的腫瘤細胞數在組織學標本中不少于100個細胞，大于一半不能為熒光染色，由于立體分析的原因。少于40個的腫瘤細胞標本陽性的FISH信號是不可信的。

陽性結果的判讀標準： 至少紅色與綠色信號之間存在一定距離，應大于等于大的信號直徑的2倍。單獨出現紅色信號時，而無綠色信號伴隨出現，提示基因由于轉化或缺失導致的融合。當單一的綠色信號出現，而無紅色信號伴隨時被認為陰性。同樣，非重排的ALK基因增加的拷貝數融合信號代表染色體的多倍體或ALK擴增，而非重排。當大于25個細胞（50%）是認為陽性。小于5個細胞是陰性（10%）；當5~25個細胞陽性（0~50%）被認為是模棱兩可的！應該重做一遍。如果重復后兩次的平均值在至少15%的陽性細胞，此時被認為陽性。

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雖然，原位雜交技術是首先被FDA推薦的一種檢測ALK融合基因技術。但它也存在許多不足之處。首先，該檢測試劑盒的價格昂貴，不利于廣泛推廣采用，同時這種方法不能明確ALK融合基因的具體變異體。另外，對于操作和判讀的要求較高，必須進行嚴格培訓的診斷醫生才能勝任。其次，多數的患者發現腫瘤時為晚期肺癌，此時已經失去手術機會，只能獲取很小的活檢組織，小活檢組織很難保證每個視野具有足夠的腫瘤細胞進行判斷。所以，此方法嚴重的限制了對大多數非小細胞肺癌患者的大規模的篩查及診斷。

免疫組化法 FISH檢測法為FDA認證的克唑替尼處方使用推薦的檢測方法。此技術最初被認為ALK融合基因檢測的金標準。但由于FISH檢測技術操作難度大，普及較為困難，以及其價格昂貴，此方法的用于ALK篩查面臨較大的阻力。因此探索其他分子診斷檢測方法成為必然。免疫組織化學法為病理醫生熟悉，其操作簡便易行，價格便宜等優點，成為潛在的篩查方法。通過大樣本和不同抗體成功的證實免疫組化法也變成較好的篩查方法。免疫組化檢測的生物前提是ALK基因異位和轉化具有多個可能存在的配體導致ALK蛋白的過表達。ALK蛋白酪氨酸激酶是克唑替尼的靶點。 因此，可以直接合理評價藥物。

目前，ALK免疫組化檢測法可以分為手動免疫組化法和由羅氏公司開發的Ventana全自動儀器操控兩種方法。免疫組化檢測法作為一種半定量實驗方法，有經濟、迅速、容易得出診斷性的實驗結果的優點，并為病理學專家熟悉。雖然使用IHC法僅僅是處于初篩狀態（尤其是手動免疫組化染色）。這種方法需要面臨如下問題：組織的前期處理、抗體的選擇、顯色信號放大系統以及評分系統等。

組織前期處理階段：包括組織的固定、固定所持續時間可能對于ALK抗原的保存情況均沒有被評價。假陰性可能由于固定較差而出現。在外科手術切除標本，陽性梯度的出現可能由于組織固定穿透性的梯度導致的。

抗體的選擇：目前針對ALK融合蛋白檢測常見的有三種抗體，即ALK1，D5F3和5A4。大量的實驗研究證明，由于非小細胞肺癌組織內ALK融合蛋白濃度相對較低，最早出現的抗體ALK1敏感性較差，僅適合用作識別間變性淋巴瘤，不適合用于非小細胞肺癌ALK融合基因的檢測。隨著不斷的探索，新一代的具有較高敏感性的抗體陸續出現，如D5F3和5A4，有研究針對這兩種抗體與FISH法進行對照研究，得出二者對非小細胞肺癌ALK融合基因檢測的敏感性和特異性分別達到了100%及95%~99%[22]。

評分系統方面的問題主要見于手動免疫組化法，ALK免疫組化陽性部位是胞漿，呈棕黃色顆粒狀改變，在一些例子同時可以表現為膜陽性。評價陽性的強度是非常主觀的，并且缺乏統一的評價標準。改良H-score法是依次使用物鏡用法評價陽性強度可以得出更統一的強度評分。通常認為在2倍或4倍物鏡下可以清楚看到陽性為（3+）；而在10倍或20倍物鏡下可以清楚看到陽性為（2+）；在40倍物鏡下可以清楚看到陽性（1+）。

采用免疫組化法需注意以下的問題。由于ALK融合蛋白表達與神經外胚層的分化有關，故其可能在正常人的神經組織和小細胞肺癌中存在表達。因此，不推薦在小細胞肺癌中使用ALK融合蛋白的免疫組化檢測。另外，在壞死組織、黏液組織以及肺泡腔內的泡沫細胞經免疫組化染色常易著色，造成假陽性結果，在判讀免疫組化染色結果時一定要加以注意。

顯色信號放大系統：羅氏的Ventana全自動儀，可以做到檢測流程及判讀結果都達到標準化。其特色的技術是使用了基于非內源性半抗原、信號擴增多聚體及辣根過氧化酶系統染色信號放大技術。不影響結果的特異性的前提下，大大提高了ALK融合蛋白檢出的敏感性。

免疫組化結果與FISH檢測的一致性：來自三個大樣本的免疫組化與FISH法對照研究結果顯示：FISH法陰性同時免疫組化法也總是陰性（一致性為100%），IHC3+陽性與FISH檢測完全一致，兩種方法存在較好的符合率[23]。因此，有的學者建議用IHC評價的病例無需再通過FISH檢驗。但是，另一些實驗室有不同的結果，免疫組化判讀為3+，而FISH檢測為陰性；也有的病例FISH檢測陽性，而免疫組化為陰性結果。因此，有學者建議所有經免疫組化法ALK陽性的病例都應該行FISH或PCR法進行驗證。

RT-PCR 此方法是一種敏感性高，而且快速出結果的分子檢測技術，即使存在較少的RNA拷貝數也可以檢測出來。因此，RT-PCR法可以用于對FISH法和免疫組化法的結果進行檢驗。也可以代替FISH法和免疫組化法單獨用于ALK融合基因的檢測。此法可以用來檢測出多個已知的ALK融合基因突變體的存在。然而其也存在一些不利因素，阻礙了其不能成為此種檢測的標準檢測方式。RT-PCR法需要高品質的RNA，需要超過1000bp的擴增子并且要恰當的低溫保存腫瘤組織，這在常規工作中是很難達到的。常規工作中，多數肺癌標本都是石蠟包埋組織，長時間后組織內RNA的降解難以避免。另外，由于ALK融合基因已知存在20多種變異體的存在，需要多組引物才能完成，這種檢測要求更復雜的系統來實現?；赗T- PCR 技術對實驗室有較高要求，這也是其難以成為 ALK 檢測主要方法之一。

對于ALK融合基因的檢測，盡管常見于上述3種方法，但有不同的研究者仍在探討一些改良方法或者創新的方法。韓國首爾國立大學評價了FISH和一種新的方法——顯色原位雜交法（chromogenic in situ hybridization，CISH），用來評價兩種方法在檢測ALK基因重排的一致性的研究。該實驗對465例NSCLC進行CISH法檢測，18例檢測出ALK基因重排，陽性率為4%。兩種檢測方法高度一致性（吻合系數為0.92）。另外，還對比了CISH與IHC檢測ALK基因狀態和ALK蛋白表達情況，也表現為較高一致性（吻合系數為0.82）[24]。

綜上所述，ALK融合基因陽性的非小細胞肺癌是肺癌的新的分子亞型，也是繼EGFR、 KRAS之后發現的又一個重要腫瘤靶點。其靶向治療藥——克唑替尼的出現為非小細胞肺癌患者帶來新的希望。在臨床工作中，要根據肺癌標本的類型合理的、 順次的進行靶點基因的篩選，依據具體檢測結果選擇相應的個體化靶向治療，最終達到提高肺癌患者的生存質量和延長生存時間的目的。

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（收稿日期：2014-02-11）

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