復(fù)方枇杷桔梗膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

謝周濤，胡 進(jìn)

（湖北省新華醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430015）

復(fù)方枇杷桔梗膏由枇杷葉、罌粟殼、桔梗、薄荷腦等9味中藥組方，具有養(yǎng)陰斂肺、祛痰鎮(zhèn)咳的功效，用于久咳勞嗽、上呼吸道炎、支氣管炎引起的咳喘痰飲等癥。罌粟殼為方中主藥，嗎啡為其主要成分之一[1－3]，但具有成癮性，必須控制其含量。為控制該制劑質(zhì)量，保證臨床療效，本試驗(yàn)中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)方中枇杷葉、罌粟殼、桔梗、薄荷腦進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定制劑中嗎啡的含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

戴安summit P680型高效液相色譜儀，summit P680A型低壓四元泵，PDA100型二極管陣列檢測(cè)器，ASI100型自動(dòng)進(jìn)樣器，summit柱溫箱，Chromeleon色譜工作站，UV－3300型掃描型紫外／可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。固相小柱（十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充，填充物250 mg，容積6 mL，天津市琛航科技儀器有限公司）；AB－265s型梅特勒（十萬(wàn)分之一）分析天平。嗎啡對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)為171201－200419）；枇杷葉對(duì)照藥材（批號(hào)為 121261－0301）；罌粟殼對(duì)照藥材（批號(hào)為110722－200309）；桔梗對(duì)照藥材（批號(hào)為121028－200907）；薄荷腦（批號(hào)為 0728－200005）；復(fù)方枇杷桔梗膏（本醫(yī)院制劑，批號(hào)分別為 100921，100922，100923，100931，100932，100933）；乙腈（色譜純，天津康巢正興科技有限公司），水為雙重蒸餾水，磷酸二氫鉀、庚烷磺酸鈉（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

枇杷葉：取樣品10 g，加水40 mL，攪勻，用乙醚振搖萃取3次，每次40 mL，乙醚層備用；合并水層，加0.5 g氫氧化鈉使溶解，搖勻，水層溶液加水飽和的正丁醇提取4次，每次30 mL；合并正丁醇液，水洗至中性，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取枇杷葉對(duì)照藥材 1 g，加水 100 mL，煎煮 30 min，濾過(guò)，濾液加氫氧化鈉配成1%的濃度，濾液按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。取缺枇杷葉的陰性樣品，同法制得陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一以0.4%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿－醋酸乙酯－甲醇－水（16 ∶38 ∶22 ∶9）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 5% 磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾(見(jiàn)圖1A)。

罌粟殼：取樣品15 g，加氨試液調(diào)pH至10，用三氯甲烷萃取3次，每次30 mL，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取罌粟殼對(duì)照藥材1.5 g，加水30 mL煎煮30 min，濾過(guò)，取濾液，同法制成對(duì)照藥材溶液。取缺罌粟殼的陰性樣品，同法制得陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄Ⅵ B]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一以0.4%羧甲基纖維素鈉為黏合劑含2%氫氧化鈉制備成的硅膠G薄層板上，以甲苯－丙酮 －乙醇－濃氨試液（20∶19∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀溶液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾(見(jiàn)圖1B)。

桔梗：取樣品15 g，加水40 mL，攪勻，用乙醚振搖萃取3次，每次40 mL，合并水層，用鹽酸試液調(diào)節(jié) pH至3，再用乙酸乙酯萃取2次，每次40 mL，分取乙酸乙酯層，合并，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取桔梗對(duì)照藥材3 g，碾細(xì)，加水，超聲提取30 min，離心，過(guò)濾，取濾液濃縮成浸膏，取2 mL浸膏，同法制成桔梗對(duì)照藥材溶液。另取桔梗陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一用0.3%氫氧化鈉調(diào)制的硅膠薄層板上，以正己烷－氯仿－甲醇（15∶11∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴25%磷鉬酸乙醇溶液后105℃顯色，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品無(wú)干擾(見(jiàn)圖1C)。

薄荷腦：取枇杷葉項(xiàng)下的乙醚提取液，揮干乙醚，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取薄荷腦對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含0.5 mg薄荷腦的溶液，作為對(duì)照品溶液。取缺薄荷腦的陰性樣品，同法制得陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄Ⅵ B]試驗(yàn)，吸取上述 3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一以0.4%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯（9∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾(見(jiàn)圖1D)。

圖1 薄層色譜圖

2.2 嗎啡含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol／L 磷酸二氫鉀水溶液 －0.002 5 mol／L 庚烷磺酸鈉水溶液 －乙腈（44 ∶44 ∶12）；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：25 ℃。理論板數(shù)按嗎啡峰計(jì)算應(yīng)不低于1 000。

2.2.2 溶液配制

精密稱取在105℃干燥1 h的嗎啡對(duì)照品適量，加30%甲醇和5%醋酸溶液制成每l mL含無(wú)水嗎啡10 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取以十八烷基鍵合硅膠為填充劑的固相小柱1支，依次用甲醇 －水（3∶1）混合溶液 15 mL及水 5 mL沖洗，再用 pH為9的氨試液50 mL沖洗備用。取本品20 g，精密稱定，置50 mL棕色瓶中，加5%醋酸溶液約25 mL，超聲10 min后加5%醋酸溶液至刻度，搖勻，離心10 min；精密移取離心上清液2 mL，置上述固相小柱上，加氨試液5 mL，待溶液滴盡后用水20 mL沖洗，再用5%醋酸溶液洗脫，用5 mL量瓶收集洗脫液至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：取陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。在選定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性對(duì)照品溶液色譜在與嗎啡對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)位置未檢測(cè)出色譜峰，表明處方中其他藥物對(duì)嗎啡的測(cè)定無(wú)干擾，該方法有較好的專屬性。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密稱取嗎啡對(duì)照品10.23 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。精密量取上述貯備液 5 mL，分別置 10，25，50，100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為 102.30，40.92，20.46，10.23 μg ／mL 的對(duì)照品溶液，再分別精密量取上述質(zhì)量濃度為 10.23 μg／mL 的對(duì)照品溶液 5 mL，置 10，25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為 5.115，2.046 μg ／mL的對(duì)照品溶液。在選訂的色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL，記錄各色譜峰峰面積，以峰面積（Y）均值為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y＝126.414 6 X－1.317 1，r＝0.999 7（n＝6）。結(jié)果表明，嗎啡進(jìn)樣量在 0.020 4～1.023 μg之間與峰面積具有良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果峰面積平均值為 13.584 3，RSD ＝1.16% （n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)（100921）的樣品6份，依法制備供試品溶液并分別測(cè)定。結(jié)果嗎啡平均含量為 74.54 μg／g，RSD＝1.66% （n＝6），表明該方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，于 0，1，2，4，6，8 h 時(shí)分別進(jìn)樣 10 μL測(cè)定。結(jié)果嗎啡峰面積平均值為13.765 2，RSD＝1.34%（n＝6），表明嗎啡溶液在 8 h時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批樣品(批號(hào)為100921，嗎啡含量為 74.54 μg／g）6 份，各約 10 g，精密稱定。另取嗎啡對(duì)照品適量，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加5%醋酸溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。分別精密移取對(duì)照品溶液，置上述供試品溶液中，照供試品溶液的制備方法操作，分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 嗎啡加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取本品6批樣品，依法制備供試品溶液并測(cè)定嗎啡含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

取嗎啡對(duì)照品溶液，置紫外分光光度儀于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果嗎啡在220.7 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，與2010年版《中國(guó)藥典（一部）》罌粟殼含量測(cè)定波長(zhǎng)相近，故選擇220 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

曾選用 0.5% 乙酸氨 － 甲醇（9 ∶1）、0.01 mol／L 磷酸氫二鉀溶液 －0.005 mol／L 庚烷磺酸鈉水溶液 －乙腈（40 ∶40 ∶20）、0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液 －0.002 5 mol／L 庚烷磺酸鈉水溶液 －乙腈（42 ∶42 ∶16；44 ∶44 ∶12）作流動(dòng)相，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果用 0.05 mol／L磷酸二氫鉀溶液 －0.002 5 mol／L庚烷磺酸鈉水溶液 －乙腈（44∶44∶12）為流動(dòng)相分離效果較理想[4]，供試品溶液色譜中嗎啡能與其他組分達(dá)到基線分離，測(cè)得嗎啡峰面積最大。

對(duì)液液萃取法和固相小柱萃取法進(jìn)行比較，后者制備樣品中嗎啡的含量高于前者。中藥膏劑含糖量較高、粘度大，且固相小柱萃取效果好、方法簡(jiǎn)便，故本試驗(yàn)選擇固相小柱萃取法作為供試品溶液的制備方法[5]。

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