PSMA對JNK/SAPK通路的激活及對前列腺癌細胞凋亡的調控*

黃 海， 賴義明， 何 旺， 董 文， 朱定軍， 張一鳴， 劉 皓， 于 浩， 畢良寬， 林天歆， 黃 健， 郭正輝， 杜 濤

(中山大學孫逸仙紀念醫院 1泌尿外科， 2產前診斷中心，廣東 廣州 510120)

前列腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)是一種前列腺上皮細胞Ⅱ型跨膜糖蛋白，由前列腺上皮細胞分泌，其氨基端位于細胞膜內，分子量約為100 kD，共含750個氨基酸，其中胞外段707個，跨膜段24個，胞內段19個。PSMA表達水平與前列腺癌病情的進展有明顯相關性，是前列腺癌天然的靶點，在前列腺癌診治及研究中有重大意義。近年來研究發現，PSMA具有信號轉導、細胞遷移、受體效應、營養攝取等功能[1-2]。其中信號轉導的機制并非完全清楚。c-Jun氨基末端激酶/應激激活的蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinases, JNK/SAPK)信號通路是細胞內重要信號通路之一，在細胞增殖及凋亡中發揮關鍵作用，并與人類多種腫瘤的發生發展密切相關[3]。本研究中，我們以阻斷或增強PSMA表達的前列腺癌細胞LNCaP細胞株作為研究對象，在一般培養基及JNK/SAPK信號通路抑制劑SP600125作用下，發現在LNCaP細胞PSMA的表達與p-JNK/SAPK水平及細胞增殖、細胞周期具有一定聯系，推測PSMA可能通過JNK/SAPK信號通路對前列腺癌的增殖及凋亡起到調控作用。

材 料 和 方 法

1 材料

利用前期研究中建立的高效阻斷PSMA表達的shRNA慢病毒載體，阻斷前列腺癌細胞中PSMA的表達作為實驗的干擾組(shPSMA)[4]；同時利用前期構建的PSMA真核表達載體pcDNA3.1-PSMA轉染前列腺癌細胞，促進前列腺癌細胞中PSMA的表達作為陽性實驗組(pcDNA-PSMA)[5-6]；不做任何處理的LNCaP細胞株(購自中山大學實驗動物中心)作為空白組(control)；加入JNK/SAPK抑制劑SP600125作為陰性對照研究。

RPMI-1640培養基和胎牛血清(HyClone)；0.25%胰酶(吉瑪公司)；Cell Counting Kit-8(Dojindo Laboratories)；兔抗人磷酸化JNK多克隆抗體(CST)；兔抗人PSMA單克隆抗體(Abcam)；3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)內參照抗體(Santa)；辣根過氧化物酶(peroxidase horseradish, HRP)標記的羊抗兔抗體(ICL)； SP600125 (CST)；BCA法蛋白定量試劑盒(上海申能博采)；柯達黑白膠片；增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(Thermo)；超敏ECL試劑盒(Millipore)；免疫組化染色試劑盒和濃縮型DAB試劑盒(中杉金橋)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Keygen)。

2 方法

2.1細胞培養 各組細胞分別于含100 mL/L FBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基中培養，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養；細胞每2 d換液，約5～6 d(細胞80%融合后)按1∶4傳代，每天觀察記錄掌握細胞基本生長規律。SP600125溶于DMSO中(25 mmol/L)，分裝備用。部分細胞凍存，備以下實驗用。

2.2細胞內JNK/SAPK蛋白磷酸化水平檢測

2.2.1Western blotting 各組細胞按每孔3×106個細胞種于6孔板中，細胞貼壁后予無血清RPMI-1640培養基換液。24 h后，一部分細胞予同樣無血清培養基換液，另一部分細胞予含25 μmol/L SP600125的無血清培養基更換，全部細胞再于培養箱中孵育30 min，即用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量，12% SDS-PAGE行3組細胞PSMA和磷酸化JNK蛋白分離，轉于PVDF膜上，封閉后，孵PSMA(1∶1 000)Ⅰ抗、p-JNK(1∶1 500)Ⅰ抗和GAPDH (1∶10 000)過夜，次日孵HRP標記Ⅱ抗(1∶1 000)1 h，暗室中加入發光液，其中PSMA使用超敏ECL發光液；p-JNK使用ECL發光液。黑白膠片曝光。

2.2.2細胞免疫化學 每組細胞按照每孔5×104個細胞接種于24孔板中培養1 d。予無血清RPMI-1640培養基換液孵育24 h，再使用一般培養基及含SP600125的培養基，外環境處理同Western blotting，多聚甲醛固定后滴入非免疫山羊血清封閉。滴入1∶1 000稀釋兔抗人p-JNK單克隆抗體100 μL；將該24孔板放入自制保濕盒中，4 ℃過夜。次日洗滌后滴入生物素標記羊抗兔IgG 1 滴/孔，室溫孵育20 min，洗滌。滴入辣根酶標記鏈酶卵白素工作液后，加入DAB液，洗脫后滴入蘇木素Mayor染核。鏡下觀察及統計分析：鏡下觀察各組細胞的染色情況，每孔隨機選取5個高倍視野(10×20)。確定細胞陽/陰性染色較為主觀，因此選取一個較為淺染的細胞為標準細胞，濃于標準細胞為陽性細胞，淺于標準細胞為陰性細胞，并對3組細胞p-JNK的表達進行統計學分析(SPSS 17.0軟件)。

2.3各組細胞增殖、細胞周期、凋亡的檢測

2.3.1CCK-8法檢測細胞的增殖 取各組細胞，消化分離后分別用含10%FBS的RPMI-1640培養基和加入含25 μmol/L SP600125的上述培養基重懸離心細胞后，通過細胞計數板人工計數，以2 000 cells/well接種于96孔板，每孔體積100 μL，每組設3個復孔，每2 d予相應的培養基換液1次(分別使用一般RPMI-1640培養基及含有SP600125的RPMI-1640培養基)。到檢測時點時取出需檢測的培養板，往培養孔中每孔加入CCK-8 試劑10 μL，后培養2 h，在酶標儀上測各組細胞的A450值，分別測24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h和168 h 7個時點，復孔檢測結果取均值并繪制生長曲線。

2.3.2流式細胞儀檢測細胞周期 各組細胞實驗前分別使用含10% FBS的RPMI-1640培養基及含SP600125的上述培養基培養48 h。消化、重懸后移入流式管，加入2 mL 于-20 ℃預冷的70%乙醇，密封后置于4 ℃冰箱過夜。次日送入流式細胞儀室對各組細胞S期、G0-G1期、G2-M期的百分比作檢測。

2.3.3流式細胞儀檢測細胞凋亡 將各組細胞制作細胞懸液(5×105個細胞)，具體方法同上，后加入1.25 μL Annexin V-FITC，室溫(18～24 ℃)避光反應15 min后離心去上清。0.5 mL預冷的1×結合緩沖液輕輕重懸后加入10 μL 溴化丙啶(propidium iodide,PI)，冰上避光保存，流式細胞術檢測分析。

3 統計學處理

計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，并采用單因素方差分析或者Kruskal-Wallis檢驗；計數資料采用Pearson2檢驗。統計分析軟件使用SPSS 17.0。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 JNK/SAPK蛋白磷酸化水平檢測結果

1.1Western blotting 如圖1所示，在PSMA高表達時，p-JNK/SAPK高表達；在PSMA低表達時，p-JNK/SAPK低表達，與空白對照組相比，均存在明顯的統計學差異。而在加入SP600125的培養基中，各組細胞中p-JNK/SAPK表達沒有顯著差異，但較常規培養組低。

1.2細胞免疫化學 圖2為用免疫細胞化學的方法觀察各組細胞p-JNK/SAPK的表達情況。對陽/陰性細胞的計數和統計表明，在RPMI-1640培養基中，shPSMA組的p-JNK/SAPK表達明顯低于control組(P<0.05)，而pcDNA-PSMA組的p-JNK/SAPK表達明顯高于control組(P<0.05)；在含有SP600125的培養基中，3組細胞p-JNK/SAPK的表達接近，無明顯差異，見圖2。

Figure 1. The expression of PSMA, JNK and p-JNK in different groups tested by Western blotting.Lane 1: shPSMA+SP600125; Lane 2: pcDNA-PSMA+SP600125; Lane 3: control+SP600125; Lane 4: shPSMA; Lane 5: pcDNA-PSMA; Lane 6: control group. Mean±SD. n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

2 細胞增殖、周期、凋亡的檢測結果

2.1細胞生長曲線 在RPMI-1640培養基中，shPSMA組的增殖能力明顯較control組低(P<0.05)，而pcDNA-PSMA組較control組高(P<0.05)，并在120 h后有顯著差異；在含有SP600125的培養基中，3組細胞增殖能力均處于低水平，但在144 h后比在RPMI-1640培養基中的shPSMA組水平更低，見圖3。

2.2流式細胞術檢測細胞周期結果 在RPMI-1640培養基中，shPSMA組、pcDNA-PSMA組和control組處于S期細胞的百分比是29.58%、42.36%和36.10%；在含有SP600125的培養基中，shPSMA組、pcDNA-PSMA表達組和control組處于S期細胞的百分比是27.51%、29.21%和28.82%。在一般RPMI-1640培養基中，shPSMA組S期細胞的百分比明顯低于control組，而pcDNA-PSMA組則高于control組；而在含SP600125培養基中，3組處于S期細胞的百分比均在較低水平，3組間無明顯差異，見圖4。

Figure 2. The expression of p-JNK/SAPK in different groups tested by immunocytochemistry (×400).Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.05 vs control group.

Figure 3. Cell growth curve of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

Figure 4. The percentage of cells in S phase detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.05 vs control group.

2.3流式細胞術檢測細胞凋亡的結果 如圖5所示，常規培養條件下，shPSMA組、pcDNA-PSMA組和control組中凋亡率分別為9.6%、3.4%和4.7%；在加入SP600125時，各組的凋亡率分別為7.7%、2.1%和3.5%。在shPSMA組中，前列腺癌細胞的凋亡率明顯高于control組，這與是否加入JNK抑制劑SP600125無關；而在pcDNA-PSMA表達組，細胞凋亡率明顯低于control組；加入JNK抑制劑SP600125后，細胞凋亡率均低于常規培養組，但是PSMA對凋亡的調控趨勢未改變。因此，PSMA可以抑制前列腺癌細胞的凋亡，JNK通路是其一條重要的通路，但是并不是唯一的通路，應該還存在其它的信號通路對細胞的凋亡進行調控。

Figure 5. Apoptotic rate of each group tested by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

討 論

PSMA是基因位于染色體11p11～12的橫跨細胞膜的Ⅱ型糖蛋白[7-8]。它是一種高特異性的前列腺癌瘤標，和腫瘤惡性程度相關。在正常的前列腺細胞中，PSMA少量表達于基底細胞[9]，在前列腺癌細胞中廣泛表達，在轉移性的雄激素非依賴性前列腺癌中有更高表達[10-11]。此外，PSMA在去勢治療后表達上調[12]。我們前期的研究也表明PSMA在前列腺癌的發生、發展中其重要作用，可以促進前列腺癌細胞的增殖、侵潤能力，抑制凋亡發生[13]，但是關于PSMA對前列腺癌細胞調控的具體機制和細胞信號通路目前還不清楚，因此我們進行了后續的研究。

JNK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)家族重要成員之一，由于它可以調控細胞內的應激反應，因此也被稱為應激激活蛋白激酶。JNK信號通路能介導多種胞外刺激誘導的細胞凋亡，參與了包括前列腺癌細胞在內的多種細胞的凋亡發生，在調控細胞凋亡中發揮著重要作用。JNK 位于胞漿，由3 個基因編碼，它們分別是：JNK1、JNK2 和JNK3。JNK1 和JNK2 基因在全身廣泛表達，而JNK3 則是呈限制性表達。這3種基因都能編碼產生46 kD和55 kD 的蛋白產物，因為3種基因的不同分布，執行的細胞功能也各有差異[14]。目前認為，JNK 促進細胞凋亡的機制主要有2點：(1)上調促凋亡蛋白的表達：JNK 通過使轉錄因子復合物AP-1 活性增強進一步促進p53、Bax、FasL、TNF 等促凋亡蛋白的表達；(2)作用于線粒體：如Bax、Bak 等促使細胞色素C釋放進入胞漿，細胞色素C和caspase-9結合，最終作用于caspase-3，激活的caspase-3與凋亡底物結合引起細胞凋亡。

PSMA是位于前列腺細胞中的一種跨膜糖蛋白，而JNK是MAPK通路中最重要的信號分子，兩者都與前列腺癌的進展相關。我們早期的研究提示，在前列腺癌細胞中，抑制PSMA表達后，前列腺癌細胞增殖、侵襲、凋亡等均受到影響[13, 15-16]，對于其具體的機制我們進行了初步探討，并證明PSMA可以對p38/MAPK通路進行調控，作為前列腺癌細胞中對p38通路調控的一個新的靶點[17]。同時，PSMA還可以對ERK通路進行調控，ERK通路同樣參與了PSMA對前列腺癌細胞生物學影響的過程[18]。那么作為MAPK通路中另一個重要的通路JNK是否也受到PSMA的影響？為了確定PSMA和JNK磷酸化是否存在關聯，以及是否對前列腺癌細胞起作用，我們設立了抑制PSMA表達的LNCaP組，增強PSMA表達組及空白組。3組分別在一般培養基和存在JNK通路抑制劑SP600125的培養基中孵育。通過檢測3組細胞在2種培養條件下的JNK/SAPK通路及細胞增殖、細胞周期、凋亡等情況來驗證PSMA對JNK/SAPK通路的調控及是否通過JNK/SAPK通路對前列腺癌細胞的凋亡產生調控。

與其它2組相比，抑制PSMA蛋白表達后，p-JNK/SAPK水平下降；增強PSMA表達后，p-JNK/SAPK水平升高；而在SP600125的作用下，3組JNK磷酸化水平均下降。細胞免疫組化結果也證明兩者之間的關系。這個結果表明PSMA參與了p-JNK/SAPK通路的激活。此外，我們檢測了3組細胞在有無JNK抑制劑情況下的增殖、細胞周期、凋亡情況。通過LNCaP細胞生長曲線表明，抑制PSMA組的生長增殖能力明顯低于空白對照組，而增強PSMA表達組則高于空白對照組；但在使用SP600125培養基組中3組生長曲線相近，而且明顯低于一般培養基組。通過流式細胞術評估各組細胞周期變化情況顯示，在常規培養條件下，抑制PSMA表達后細胞S期百分比少于空白對照組；增強PSMA表達后則高于空白對照組；在SP600125培養基條件下，3組的S期百分比幾乎相同。這個細胞周期檢測的結果顯示PSMA通過激活JNK通路來調控前列腺癌細胞周期。關于凋亡的檢測顯示在抑制PSMA表達組中，前列腺癌細胞的凋亡率明顯高于增強PSMA表達組和空白對照組，這與是否加入JNK抑制劑SP600125無關；而在增強PSMA表達組，細胞凋亡率明顯低于空白對照組；加入JNK抑制劑SP600125后，細胞凋亡率均低于常規培養組，但是PSMA對凋亡的調控趨勢未改變。因此，結合我們前期的研究結果可以推斷PSMA可以抑制前列腺癌細胞的凋亡，JNK通路是其中一條重要的通路，但是并不是唯一的通路，應該還存在其它的信號通路對細胞凋亡進行調控，比如ERK、p38、Akt等[19]。而這些通路之間的相互作用關系還不清楚，我們后期的研究將進一步進行該方面的深入研究，以闡明PSMA下游的信號通路網。

[參 考 文 獻]

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