Cdc25a在跨種屬肝癌組織中的表達及其意義*

盧曉旭， 曹 驥， 李 瑗， 孫 雯， 朱伶群， 楊 春， 蘇建家

(廣西壯族自治區腫瘤防治研究所，廣西 南寧 530021)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC; 以下簡稱肝癌)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發生發展是一個涉及多因素、多階段、多基因變異積累的復雜演變過程，如何尋找共識的肝癌關鍵分子是目前早期診斷和靶向治療肝癌的基礎之一。跨種屬篩選腫瘤基因策略[1]指通過探索比較某些腫瘤在不同種屬的基因表達譜中共同擁有的基因改變，篩選出該腫瘤發生發展中起關鍵作用的分子。本研究應用跨種屬腫瘤基因篩選策略，結合前期研究[2-3]，通過基因富集及meta分析方法，從5套不同種屬的肝癌基因表達芯片中篩選出細胞周期通路中的細胞分裂周基蛋白25a(cell division cycle 25a protein,Cdc25a)等差異表達有統計學意義的基因，通過采用實時熒光定量PCR及Western blotting方法檢測其在人、嚙齒類動物大鼠和低等靈長類動物樹鼩3個種屬的肝癌、癌旁及正常肝組織中的表達，以驗證前期生物信息學分析的結果，并探討Cdc25a在肝癌發生發展中的可能作用及意義。

材 料 和 方 法

1 標本收集

1.1人肝組織標本 收集廣西醫科大學附屬腫瘤醫院2009年1月～2011年12月手術切除并經病理證實的38例肝癌及對應癌旁組織(距離腫瘤邊緣2 cm以外)和10例正常肝組織，正常肝組織來源于肝良性占位病變經手術切除者。肝癌病人術前均無放療化療史，患者年齡在24～70歲，中位年齡47.5歲。術后隨訪1年期間，出現術后復發共20例。

1.2大鼠和樹鼩肝組織標本 課題組前期項目已建立用黃曲霉毒素B1誘導肝癌的大鼠及樹鼩動物模型。此次實驗取大鼠肝癌及其相應癌旁組織各15例、正常肝組織14例，以及樹鼩肝癌及其相應癌旁組織10例、正常肝組織10例。所有組織均為手術切除后先經液氮速凍然后轉移到-80 ℃；肝癌標本均經病理組織學檢查證實。

2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen，逆轉錄試劑盒購自Fermentas，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR產物純化采用杭州博日公司的Biospin膠回收試劑盒，熒光定量試劑盒為TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司的SYBR? Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) 試劑盒。Cdc25a Ⅰ抗購自Abcam，GAPDH Ⅰ抗購自北京中杉金橋公司，熒光紅外Ⅱ抗購自LI-COR。實時熒光定量PCR儀為ABI生產的ABI StepOneTM，Odyssey紅外熒光成像儀為LI-COR產品。

3 方法

3.1實時熒光定量PCR 采用Trizol試劑提取組織總RNA；經微量核酸測定儀檢測，A260/A280在1.8～2.0之間為合格；以1.0%瓊脂糖電泳和凝膠成像系統檢測所提取的總RNA的完整性；取檢驗合格的RNA，按Fermentas公司逆轉錄試劑盒說明書進行cDNA合成，產物于-20 ℃保存。根據熒光定量PCR引物設計原則，應用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟件進行引物設計。Cdc25a上、下游引物序列分別為5′-CCAAAGGAACCATTGAGAAC-3′和5′-CAGATGCCATAATTTCTGGAG-3′，產物長度為138 bp；內參照基因GAPDH上、下游引物序列分別為5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′和5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′， 產物長度為200 bp。

根據試劑盒說明書，采用20 μL反應體系分別以Cdc25a和GAPDH引物進行擴增。反應體系含：SYBR? Premix Ex Taq (2×)10 μL，PCR引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX reference dye(50×)0.4 μL，滅菌去離子水6.8 μL，cDNA模板2 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s; 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。同時，分別構建Cdc25a和GAPDH的標準曲線，并設置標準品的梯度稀釋拷貝數。PCR擴增結束后，分析儀即顯示標準曲線、擴增曲線和熔解曲線，根據各自標準曲線計算出待測樣本中初始mRNA相對表達量。計算各組Cdc25a與對應內參照基因GAPDH相對mRNA表達量的比值，得到肝癌組、癌旁組和正常組3組數據作為Cdc25a mRNA的相對表達量。將PCR擴增產物送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序，并將測序結果在NCBI的BLAST中進行比對。

3.2Western blotting檢測Cdc25a蛋白 分別取各例組織樣本50～100 mg, 常規方法提取總蛋白，加入上樣緩沖液煮沸變性，加樣進行SDS-PAGE，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜；加Ⅰ抗(Cdc25a工作液濃度 1∶100，GAPDH工作液濃度1∶1 000)，過夜孵育，洗膜；加熒光Ⅱ抗(工作液濃度1∶10 000)，室溫避光孵育1 h，洗膜；以Odyssey紅外熒光成像儀掃描圖像。

4 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件處理。數據用均數±標準差(mean±SD)表示；多組間均數的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 總RNA質量及基因測序

所有樣本總RNA的A260/A280比值在1.8～2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳后成像顯示28S、18S和5S條帶清晰，提示總RNA質量較好。PCR產物測序結果良好，所得序列經BLAST比對顯示各序列的同源性一致，即擴增產物序列與設計序列一致。

2 實時熒光定量PCR反應

Cdc25a和GAPDH的標準曲線決定系數(R2)分別為0.999和0.997，提示直線擬合度良好；斜率(slope)分別為-3.423和-3.614，提示其可在較寬廣的范圍內進行定量分析。擴增曲線均呈S型，有明顯的指數擴增期和平臺期，曲線走行光滑，顯示擴增結果理想。熔解曲線峰形窄而尖，峰單一無雜峰，說明擴增產物特異性良好，見圖1。

Figure 1. Real-time fluorescence quantitative PCR melting curves of Cdc25a and GAPDH.

3 Cdc25a mRNA在人、大鼠和樹鼩的肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達

實時熒光定量PCR結果顯示，人肝癌組織Cdc25a mRNA表達量為0.00425±0.00241，高于其對應的癌旁組織(0.00086±0.00081)及正常肝組織(0.00038±0.00032)，差別均有統計學意義(P<0.05)；癌旁組織與正常組的差別無統計學意義(P>0.05)。Cdc25a mRNA表達量在大鼠肝癌組織為0.00281±0.00278，高于其對應的癌旁組織(0.00044±0.00035)及正常肝組織(0.00051±0.00022)，差別均有統計學意義(P<0.05)；癌旁組織與正常組織的差別無統計學意義(P>0.05)。Cdc25a mRNA表達量在樹鼩肝癌組織為0.00043±0.00021，高于正常肝組織(0.00022±0.00010)，差別有統計學意義(P<0.05)；癌旁組織(0.00028±0.00017)與對應的肝癌組織及正常肝組織比較，差別無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

4 HCC組織中Cdc25a mRNA表達與臨床參數的關系

由表1可見，Cdc25a在人肝癌組織中的檢出率與臨床分期、門靜脈癌栓及肝外轉移明顯相關，而與術后復發、腫瘤直徑、腫瘤數目、血清甲胎蛋白水平及腫瘤分化程度無明顯關系。

5 Cdc25a蛋白在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達

在預染色蛋白約36 kD及59 kD處分別可見內參照GAPDH及Cdc25a特異性蛋白條帶，但目的蛋白Cdc25a在人正常肝組織、大鼠癌旁及正常肝組織和樹鼩癌旁及正常肝組織處未掃描到條帶。Cdc25a在人肝癌組織中的平均表達量(0.339±0.239)明顯高于其在對應癌旁組織中的平均相對表達量(0.0609±0.0498)，差別有統計學意義(P<0.05)；在人、大鼠和樹鼩的肝癌組織中，Cdc25a的條帶明顯強于癌旁及正常肝組織，與Cdc25a mRNA在肝癌組織的高表達一致，見圖3。

Figure 2. The mRNA expression of Cdc25a in the HCC tissues, HCC-adjacent liver tissues and normal liver tissues of humans, rats and tree shrews.Mean±SD.*P<0.05 vs HCC tissues.

Figure 3. Western blotting analysis of Cdc25a protein levels in human (A), rat (B) and tree shew (C) hepatocellular carcinoma tissues. 1, 3: HCC tissues; 2, 4: adjacent liver tissues of HCC; 5, 6: normal liver tissues.

討 論

幾乎所有的癌癥都表現為細胞周期的紊亂和不規則，例如調控細胞周期分子的缺失、過表達及突變[4]。細胞周期活性的控制機制主要通過周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)、周期蛋白(cyclins)及周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子(CDK inhibitors, CKIs)蛋白調控。Cdc25磷酸酶在CDKs去磷酸化激活中起重要作用。Cdc25a作用于cyclin A/CDK2和cyclin E/CDK2，促進細胞從G1期進入S期[5]。Cdc25a作為可活化在細胞周期調控中起核心作用的CDK/cyclin復合體的因子，其過表達可導致細胞周期調控紊亂及對DNA損傷不應答引起細胞異常增殖，甚至腫瘤的發生。

Cdc25a在多種惡性腫瘤[6-8]中呈現高表達，且許多實驗證實了其與腫瘤的惡性程度和預后差有關，但是Cdc25a在肝癌組織的表達和臨床意義在國內還鮮有報道。2003年Xu等[9]用RT-PCR、免疫組化及Western blotting等方法在mRNA及蛋白水平上檢測了肝癌組織中Cdc25a的高表達情況，分別為：69%(9/13)、56%(33/59)及78%(46/59)，并且在免疫組化方法檢測時，發現Cdc25a蛋白的高表達與腫瘤低分化、門脈癌栓轉移呈正相關。本研究利用熒光定量PCR和Western blotting檢測方法發現Cdc25a在人肝癌組織中轉錄和翻譯水平上均呈高表達，與之前Xu等[9]的研究結果相符合。本研究利用Western blotting檢測Cdc25a蛋白水平時，發現其在癌旁組織及正常肝組織條帶幾乎無法辨認，此現象可能與其在應激反應時和正常細胞時相間期被水解有關；Cdc25a正常情況下使cylin E/CDK2和cyclin A/CDK2在起始點激活，促進細胞增殖。Cdc25a蛋白在肝癌組織中高表達，可能與其在肝癌發生發展過程中使癌細胞無限增殖有關[10]。

本研究亦發現Cdc25a在黃曲霉毒素B1誘發的大鼠、樹鼩肝癌組織中也呈過表達，一致的表達差異趨勢與我們前期已報道的跨種屬分析基因芯片數據結果[2]及本實驗室之前用cDNA陣列技術研究黃曲霉毒素B1誘發樹鼩肝癌形成過程中基因變化發現的結果[11]相符合。跨種屬表達驗證實驗說明Cdc25a在肝癌發生發展中起重要作用。進一步研究Cdc25a mRNA在人肝癌組織中的表達水平與臨床參數的關系，發現Cdc25a在人肝癌組織中的表達與臨床分期、門靜脈癌栓及肝外轉移呈正相關，這表明Cdc25a與肝癌患者的病程進展有關，有可能作為評估病情嚴重程度的參考指標。考慮到樣本例數的差異、轉錄與翻譯水平的差異、實驗方法的差異等，本研究結果與前面所述Xu等[9]結果不完全相同可能與此有關。

Xu等[12]嘗試抑制Cdc25a在肝癌細胞系的活性來闡述其作為抗腫瘤靶點的可能性，結果發現Cdc25a反義寡核苷酸在48 h內導致25%～50%細胞生長被抑制，停滯在G0/G1期，有效抑制了肝癌腫瘤細胞的增殖，再次表明Cdc25a在治療腫瘤方面是一個可行的靶點。Liu等[13]研究Rock2在信號通路的作用及對肝癌影響時發現，Rock2降低后可激活泛素-蛋白酶體通路，進而促進Cdc25a泛素化，最終使得Cdc25a降解；并且降低Rock2表達可增強DNA損傷時肝癌細胞生長的抑制作用。總之Cdc25a有望成為抗肝癌細胞的治療新靶點。

本研究結果中Cdc25a在人、大鼠和樹鼩3個種屬的肝癌組織中mRNA及蛋白表達水平均上調，提示其表達水平的改變可能在肝癌發生發展中起重要作用。同時，本研究結果也證實了跨種屬篩選腫瘤相關基因的可行性，為更全面了解肝癌及其它腫瘤的關鍵基因改變提供一個新的思路。

[參 考 文 獻]

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