滅活HIV-1顆粒引發小膠質細胞鈣離子內流和NF-κB核轉位的研究*

黃秀艷， 曾耀英

(暨南大學免疫生物學系，廣東 廣州 510632)

在未使用抗逆轉錄病毒治療人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus， HIV)疾病之前(從HIV感染到獲得性免疫缺陷綜合征發病的整個進程)，大約有20%～30%的患者出現一系列的認知和運動障礙癥狀，其中包括短期記憶受損、注意力降低和腿軟等，統稱為HIV相關性失智癥(HIV-associated dementia, HAD)。高效抗逆轉錄病毒治療(highly active antiretroviral therapies, HARRT)可使HAD的發病率降低到10%，這可能與HARRT使患者血液病毒復制得到控制從而降低了血漿病毒載量有關。但是，輕型認知障礙(mild neurocognitive disorder, MND)和無癥狀認知損害(asymptomatic neurocognitive impairment, ANI)則成為HIV-1(下文省略為HIV)感染時的中樞神經系統(central nervous system, CNS)主要并發癥[1-3]。對于HIV感染所致的神經退行性病變的發生機制，人們首先想到的是神經細胞可能因為HIV感染而出現結構破壞和功能障礙，然而神經細胞不表達HIV感染所必需的CD4分子，到目前為止沒有證據表明其能被HIV感染。因此，排除神經細胞丟失是由于HIV直接感染而導致的。在中樞神經系統中，能夠被HIV感染細胞只有腦內血管旁巨噬細胞(perivascular macrophage)和小膠質細胞(microglia)，因為它們才表達HIV-1入胞所必需的受體和共受體[2-3]。目前普遍認為，HIV感染小膠質細胞引起神經細胞損害的可能機制包括：HIV編碼的蛋白直接誘導神經細胞凋亡；HIV引發的炎癥介質而導致神經細胞死亡。以下事實使我們推測HIV顆粒(HIV particles，HIVp)可能參與了HAD的發病：HAD常見于治療不成功或沒有接受HARRT的晚期HIV感染者，說明HAD的發作與血漿高病毒載量密切相關；HIV 糖蛋白gp120能活化人小膠質細胞[4-5]。最值得思考的是，HIVp除了包含病毒自身編碼的蛋白外，還包含大量的宿主蛋白，而且這些宿主蛋白是有某些生物學功能的，是由于進化壓力而整合到病毒顆粒中的(為了成功地復制，HIV必須逃脫宿主的免疫系統并借用宿主的代謝系統，而宿主則進化了一整套清除HIV的機制，這些宿主蛋白就是病毒和宿主相互作用留下的痕跡)[6]。對于病毒表面的宿主蛋白是否具有致病性目前尚所知甚少。為此，我們將HIVp和gp120所引發的小膠質細胞鈣內流效應進行對比研究，以闡明HIVp在HAD發病中的作用機制。

NF-κB是細胞內最為重要的核轉錄因子，它參與調控細胞對應激的反應，尤其在調制感染免疫應答中起著中心作用。其活性的重要評價指標是發生核轉位(nuclear translocation)，而小膠質細胞中NF-κB由胞漿轉到胞核是細胞活化的重要標志[7]。為此，本研究將NF-κB作為評價HIVp引起小膠質細胞活化的參數之一。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞 原代人小膠質細胞由本實驗室培養純化后冷凍保存[8]。H9/HIV-1IIIB細胞系由南方醫科大學免疫教研室惠贈；滅活HIV-1SF162由香港大學微生物系惠贈；C8166細胞系由中國科學院昆明動物研究所分子免疫室惠贈。

1.2試劑和儀器 離心管、培養瓶、吸管和培養板均為Corning產品；青霉素和鏈霉素、無Ca2+和Mg2+的HBSS液、Trypsin-EDTA、DMEM/F12培養基和胎牛血清(fetal calf serum，FCS)購自HyClone；離子霉素(ionomycin，Ion)和2,2’-二硫二吡啶(2,2’-dithiodipyridine;商品名AldrithiolTM-2，AT-2)購自Sigma-Aldrich；HIV-1MNgp120重組蛋白(gp120-X4)購自ABI；HIV-1SF162gp120重組蛋白(gp120-R5)購自北京博菲康生物技術有限公司。25 mm直徑圓形蓋玻片為ESM產品；NF-κB p65購自Santa Cruz，Alexa Fluor-546 標記的Rabbit Anti-Mouse IgG、ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI、Fluo-4 AM、 F-127和Attofluor Cell Chamber購自Invitrogen；激光共聚焦系統為PerkinElmer產品。

2 方法

2.1AT-2滅活HIV-1IIIB和HIV-1SF162的制備 按照文獻[9-10]所述的制備方法用AT-2滅活HIV-1IIIB和HIV-1SF162，用p24抗原檢測試劑盒檢測其p24抗原量。

2.2共聚焦顯微鏡術檢測小膠質細胞鈣離子濃度 將調整好濃度的小膠質細胞懸液接種于鋪有圓形蓋玻片的6孔培養板中，每孔定容為3 mL，37 ℃、5% CO2條件下培養過夜。次日，取出蓋玻片，置于Chamber上，加入5 μmol/L Fluo-4溶液[5 μL 1 mmol/L儲存液加入到5 μL F-127促滲透劑中，混勻，加入990 μL Locke’s溶液(154 mmol/L NaCl, 5.6 mmol/L KCl, 3.6 mmol/L NaHCO3, 1.3 mmol/L CaCl2, 1 mmol/L MgCl2, 5 mmol/L葡萄糖和10 mmol/L HEPES, pH 7.4)] 250 μL，37 ℃、5% CO2條件下孵育30 min。然后，用Locke’s溶液洗滌2次。最后，加入250 μL Locke’s溶液，上機檢測。所有數據通過PerkinElmer公司Ultraview System軟件中的Temporal程序獲取和分析。試劑加入順序及劑量見圖1～4。

2.3NF-κB核轉位的檢測 小膠質細胞黏附生長于蓋玻片上，用滅活的HIVp(病毒濃度以p24抗原含量計算為10 μg/L)刺激小膠質細胞。2 h后，3.7% 多聚甲醛固定細胞15 min，然后用通透液(含1% Triton X-100，含5% BSA的PBS)通透細胞，NF-κB p65抗體(1∶100)于4 ℃孵育過夜，洗滌3次，加入Alexa Fluor-546標記的Rabbit Anti-Mouse IgGⅡ抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，洗滌3次，封片后，共聚焦顯微鏡拍照。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示。各組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HIVp-X4激發的小膠質細胞鈣離子內流效應較HIVp-R5強

如圖1、2所示，無論是R5型HIVp(HIVp-R5)還是X4型HIVp(HIVp-X4)都能有效地刺激人小膠質細胞產生鈣離子內流效應。當黏附在蓋玻片的小膠質細胞用Fluo-4染色后，即使未使用激動劑，在激光照射下也產生一定強度的熒光(圖1A-1和B，圖2A-1和B)，當加入滅活的HIVp(病毒濃度以p24 抗原含量計算為10 μg/L，本文使用的HIVp-R5和HIVp-X4均調整為此濃度)后，顯微鏡視野范圍內細胞的熒光強度立即增加(圖1A-2和B，圖2A-2和B)，在其后的數百秒的時間內維持一定水平(圖1A-3和B，圖2A-3和B)。當加入5×10-6mol/L鈣離子導入劑Ion后，視野里所有細胞的圖像“熱起來”，即胞內鈣離子濃度大幅升高(圖1A-4和B，圖2A-4和B)。如圖1C、2C所示，gp120-R5和gp120-X4所引發的鈣離子升高絕對值的平均數分別為(20.10±2.30)和(22.10±3.10)灰度單位，HIVp-R5和HIVp-X4所引發的鈣離子升高絕對值的平均數分別為(38.50±9.02)和(70.30±8.72)灰度單位，而Ion激發鈣離子升高的絕對值的平均數分別為(96.25±12.34)和(97.81±10.87)灰度單位。在相同劑量的HIVp-R5和HIVp-X4的條件下，無論是用絕對的灰度單位或者用與Ion所引發鈣離子內流效應相對值來計算，HIVp比gp120所引發的鈣離子內流效應要強得多；而且HIVp-X4所引發的鈣離子內流效應要比HIVp-R5強。

Figure 1. Stimulatory effect of gp120-R5 and HIVp-R5 on calcium ion influx in microglia compared with ionomycin (Ion).Four cells monitored in the field of view were labeled as a, b, c and d, while four time points recorded in the experiment were marked as 1, 2, 3 and 4. A: representative images at different time points; B: representative intracellular calcium changes within each cell; C: statistical data from three independent experiments. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs gp120-R5 group; ##P<0.01 vs HIVp-R5 group.

Figure 2. Stimulatory effect of gp120-X4 and HIVp-X4 on calcium ion influx in microglia compared with ionomycin (Ion). Four cells monitored in the field of view were labeled as a, b, c and d, while four time points recorded in the experiment were marked as 1, 2, 3 and 4. A: representative images at different time points; B: representative intracellular calcium changes within each cell; C: statistical data from three independent experiments. Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs gp120-X4 group; ##P<0.01 vs HIVp-X4 group.

2 gp120對HIVp引發小膠質細胞鈣離子內流效應的影響

如圖3所示，當加入3 mg/L HIV-1糖蛋白gp120-X4時出現一定強度的鈣離子內流，細胞內鈣離子平均升高(20.44±2.83)灰度單位。如果不通過更換溶液把所加入的gp120清除，細胞內鈣離子可以持續此水平至少數百秒，此時加入滅活HIVp-X4，小膠質細胞內的鈣離子出現明顯升高，平均升高(53.33±8.07)灰度單位。當細胞內鈣離子處于平臺期，再加入5×10-6mol/L Ion，此時細胞內鈣離子大幅度升高，平均升高(98.89±17.16)灰度單位。如圖4所示，當加入3 mg/L HIV-1糖蛋白gp120-X4時出現一定強度的鈣離子內流，細胞內鈣離子平均升高(21.00±3.09)灰度單位；通過更換溶液把所加入的gp120清除，鈣離子水平隨即下降，可以降到基礎水平，此時加入滅活HIVp-X4，小膠質細胞的細胞內鈣離子水平出現明顯升高，平均升高(70.22±16.22)灰度單位。當細胞內鈣離子處于平臺期，再加入5×10-6mol/L Ion，此時細胞內鈣離子水平出現一定程度的升高，平均升高(98.33±14.07)灰度單位。對圖3、4進行比較性分析，兩者所不同的是圖3的實驗是保留先前所加入的gp120，而圖4的實驗則通過更換溶液把所加入的gp120去除，相同劑量的HIV病毒顆粒在存在gp120的情況下所引發的鈣離子內流效應要比清除先前加入的gp120后加入HIV病毒顆粒所引發的鈣離子內流效應強度小。

Figure 3. Stimulatory effect of HIVp-X4 on calcium ion influx in the presence of gp120-X4 in human microglia compared with ionomycin (Ion).Four cells monitored in the field of view were labeled as a, b, c and d, while five time points recorded in the experiment were marked as 1, 2, 3, 4 and 5. A: representative images at different time points; B: representative intracellular calcium changes within each cell; C: statistical data from three independent experiments. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs gp120-X4 group; ##P<0.01 vs HIVp-X4 group.

Figure 4. Stimulatory effect of HIVp-X4 on calcium ion influx after removal of gp120-X4 in human microglia compared with ionomycin (Ion). Four cells monitored in the field of view were labeled as a, b, c and d, while five time points recorded in the experiment were marked as 1, 2, 3, 4 and 5. A: representative images at different time points; B: representative intracellular calcium changes within each cell; C: statistical data from three independent experiments. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs gp120-X4 group; ##P<0.01 vs HIVp-X4 group.

3 HIVp-X4引發更為明顯的NF-κB核轉位

如圖5所示，HIVp刺激小膠質細胞2 h后進行免疫熒光染色觀察，結果顯示對照組中，NF-κB較為均勻地分布在胞漿中，而加入HIVp-R5組，(15.30±4.10)%小膠質細胞出現了明顯的NF-κB核轉位，而加入HIVp-X4組，(92.73±2.80)%小膠質細胞出現了顯著的NF-κB核轉位。

Figure 5. Detection of NF-κB nuclear translocation (yellow arrow indicated) induced by HIVp-X4 and HIVp-R5 in human microglia using confocal microscopy.

討 論

HIV感染者的CNS并發癥主要表現為腦炎和失智。其病理變化包括：CNS白細胞浸潤、小膠質細胞活化、趨化因子異常表達、血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)受損和神經細胞丟失等[1-4]。正如系統性HIV感染是從HIV及HIV感染細胞跨越黏膜屏障開始的一樣，HAD也是從HIV及HIV感染細胞跨越BBB開始的。目前認為，HIV是通過“木馬”策略而跨越BBB進入腦內的，也就是說，通過感染HIV的單核細胞(常常是R5型)和CD4+的T淋巴細胞(記憶T細胞為R5，na?ve T細胞為X4)跨血管內皮遷移而把病毒帶進CNS。除了來自血液的感染了HIV的細胞與腦內未感染的巨噬細胞或小膠質細胞通過融合而發生感染外，從感染細胞釋放出來的游離HIV病毒子與腦內未感染的巨噬細胞或小膠質細胞直接接觸而發生感染是可能的[1]。根據數學模型計算HIV-1在體內動力學的研究表明[11]，HIV-1的生活周期平均為2.2 d，世代時間平均為2.6 d，病毒子在血漿停留時間為0.3 d，體內每天產生病毒子數為10.3×109。 因此，推理在HIV感染的CNS的細胞間液中，游離的病毒子也停留一定的時間，即在腦內存在游離的HIV病毒子與小膠質細胞相互作用是具有時間和空間基礎的。因此，無論是R5還是X4型的病毒顆粒與小膠質細胞直接接觸是完全可能的。我們通過HIVp與小膠質細胞直接接觸研究HIV的生物學行為是與自然發生的事件相仿，因此是合理的。

本研究在方法學上可取之處在于，把AT-2滅活的HIVp作為激動劑并以鈣離子內流和NF-κB核轉位作為指標評價人小膠質細胞的活化應答。AT-2是通過共價修飾NCp7中的鋅指結構而破壞HIV-1的感染性，但仍保留了HIV-1顆粒構象和功能的完整性，而且HIV出胞時所攜帶的宿主細胞來源的蛋白構象和功能的完整性也沒有被破壞[10]。這種策略既可以使我們在常規的實驗條件下進行HIV的生物學活性的研究成為可能，又可以把HIV對宿主細胞作用的非感染活性和感染活性分離開來研究。最重要的是，與單個病毒蛋白相比，應用病毒顆粒進行研究似乎已經在方法論上從還原性研究到整合性研究更加向前邁進一步。此外，我們以ION所引發的最大鈣離子內流效應作為HIVp和gp120所引發的鈣離子內流效應強度的內在參照標準，排除因細胞狀態和Fluo-4染色差異造成的影響，從而增加HIVp與gp120及每次獨立實驗中所引發鈣離子內流效應強度的可比性。

我們的研究結果表明，無論是HIVp-R5或HIVp-X4，還是gp120-R5或gp120-X4都能刺激小膠質細胞產生明顯的鈣離子內流。HIV是通過gp120與靶細胞受體CD4和共受體C-C型趨化因子受體5(C-C chemokine receptor type 5，CCR5)或C-X-C型趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4)接觸而引發入胞。Albright等[12]證實趨化因子巨噬細胞炎癥蛋白1(macrophage inflammatory protein 1，MIP-1)和基質細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)通過激活其相應的受體CCR5和CXCR4在人小膠質細胞引發鈣離子內流。Melar等[13]證實HIVp和gp120能刺激T細胞鈣離子內流并且證明是通過激活受體CCR5和CXCR4。由此推理，滅活HIVp和gp120在小膠質細胞所引發的鈣離子內流也是通過激活共受體CCR5和CXCR4。Hoffmann等[14]證實小膠質細胞活化是鈣離子依賴的，也就是說無論是HIVp還是其gp120都能有效地使小膠質細胞活化。由于小膠質細胞活化不但上調HIV共受體增加對HIV感染的容許性，而且使細胞進入增殖周期而增加HIV復制的支持性。

基于預實驗結果(數據未顯示)，本研究中我們所加入的病毒量以及gp120量均能保證引發最強的鈣離子內流效應，但發現HIVp激發的鈣離子內流強度高于gp120，原因分析如下：首先，我們所使用的gp120為非三聚體(單體)，而在HIVp上gp120為三聚體；此外，HIV出胞時攜帶多種宿主蛋白[6,15]，而小膠質細胞上有這些蛋白的功能受體，可能通過配體與受體的相互作用而協同促進鈣離子內流。為了分析HIVp引發小膠質細胞鈣離子內流的可能作用位點，我們在加入gp120的基礎上再加入HIVp以觀察鈣離子內流變化。我們發現：在使用最大劑量的gp120引發最強的鈣離子內流的基礎上，HIVp依然可以進一步增強鈣離子內流。此外，我們還發現，在不洗去先前加入的gp120的條件下HIVp所引發的鈣離子內流反應較弱，而在洗去先前加入的gp120的條件下HIVp所引發的鈣離子內流較強。這提示gp120與HIVp可以競爭結合相同位點，從而部分阻斷HIVp的刺激作用，因為弱的激動劑可以是強的激動劑的拮抗劑。

HIV-1早期感染是以R5型的病毒占優勢，在HIV病的進程中出現從R5向X4轉換的現象，這一轉換提示CD4+T細胞丟失加快，疾病發展加速。到了晚期至少有50%患者為X4型病毒感染。與此同時，HAD也常見于HIV感染的晚期，這就提示HAD與X4型病毒感染可能有某種聯系。我們的實驗顯示HIVp-X4在小膠質細胞所引發的鈣離子內流要強得多，從而我們推測，在HIV感染的晚期因BBB通透性增加從而導致跨越BBB的X4病毒量增加而加速HAD的發生發展。

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