Api6在高脂高膽固醇飲食引起肺部炎癥中所發揮作用的研究*

張 戀， 方 嚴， 陳 婷,， 陳 可， 練雪梅△

(重慶醫科大學 1感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室脂質研究中心，2公共衛生與管理學院營養與食品衛生學教研室，重慶 400016)

凋亡抑制因子6(apoptosis inhibitor 6，Api6)，也叫做AIM、Spα或者CD5L，是清道夫受體富含半胱氨酸殘基B族成員[1]。早期研究發現Api6主要在巨噬細胞上表達，具有抑制多種刺激因素引起的細胞凋亡的作用[1-2]。最近研究表明，Api6在動脈粥樣硬化斑塊泡沫細胞里面有大量表達，而且它的大量產生促進動脈粥樣硬化斑塊巨噬細胞的存活，進一步研究發現，減少Api6的表達可以通過增加巨噬細胞的凋亡來減少斑塊早期的發展[3]。當用高脂飲食喂養小鼠時，發現Api6基因敲除小鼠有顯著的阻止巨噬細胞浸潤到脂肪組織的作用[4]。我們以前研究發現，溶酶體酸性脂肪酶(lysosomal acid lipase,LAL)基因敲除小鼠肺部存在漸進性的慢性炎癥，同時發現Api6的表達明顯增高，而LAL在水解細胞甘油三酯和膽固醇酯中起著核心的作用[5-6]。至今尚不清楚高脂高膽固醇飲食是否會引起C57BL/6J小鼠的肺部炎癥，而且研究Api6在此模型下對于小鼠肺部炎癥的作用未見報道。本研究通過高脂高膽固醇飲食喂養小鼠建立模型，觀察此模型下是否引起小鼠肺部炎癥反應及Api6在該炎癥反應中所扮演的作用。

材 料 和 方 法

1 動物和飼料

野生型C57BL/6J小鼠購買和飼養于重慶醫科大學實驗動物中心。小鼠的喂養和取材均在無特定病原體動物防護的SPF環境中完成。

6～8周的雄性C57BL/6J小鼠被隨機分成2組，一組喂養高脂高膽固醇飲食[high-fat high-cholesterol diet，HFD/HCD;40 Kcal% 脂肪, 1.25% 膽固醇和 0.5% 膽酸鹽(D12109c，Research Diets Inc.)]，另一組喂養匹配的正常飲食[regular diet, RD;10 Kcal%脂肪，不含膽固醇和膽酸鹽(D12102c,Research Diets Inc.)]。飼養16周后取材進行實驗。

2 主要儀器和試劑

2.1主要儀器 熒光定量PCR儀購自Bio-Rad；引物設計軟件采用Primer Express Software Version 2.0；免疫印跡信號檢測儀購自Fusion；流式細胞儀購自Becton Dickinsion；凝膠電流儀和電轉儀購自Bio-Rad。

2.2主要試劑 CD68抗體購于武漢博士德生物工程有限公司；Api6抗體惠贈于日本東京大學Miyazaki教授；肝X受體肝X受體α(liver X receptor α,LXRα)抗體購于Santa；β-actin內參照蛋白抗體購于北京中杉金橋公司；RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒均購于大連TaKaRa；蛋白提取試劑盒和BCA法蛋白測定試劑盒均購于南京凱基生物有限公司；凋亡試劑檢測盒購于羅氏公司；化學發光檢測試劑購于Millipore；氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)購自廣州奕源公司；ELISA試劑盒購自Raybiotech。

3 方法

3.1免疫組織化學實驗 不同飲食喂養16周的小鼠被麻醉后，通過切斷下腔靜脈和左腎動脈放血致死。取出肺組織并放入4%多聚甲醛中4 ℃過夜，第2天再通過一系列梯度乙醇脫水后用石臘包埋。把石蠟標本切成5 μm厚度的切片后用兔多克隆抗CD68抗體作為Ⅰ抗進行孵育。洗滌后用生物素化標記的Ⅱ抗進行孵育處理。最后用辣根過氧化物酶標記的生物素-親和素復合物進行檢測并用二氨基聯苯胺四鹽酸鹽作底物增強信號。

3.2蛋白的提取和蛋白印跡實驗 肺組織使用凱基公司的蛋白提取試劑盒按說明書提取全蛋白并保存于-80 ℃冰箱。用凱基公司BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，并用蒸餾水標準化各組蛋白濃度使濃度一致。將蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移至硝酸纖維膜上，然后把該膜用相應Ⅰ抗和Ⅱ抗孵育，洗滌后用電化學發光試劑進行檢測。蛋白條帶強度用ImageJ軟件進行定量分析。

3.3核酸的分離、擴增和分析 取出已經收集的小鼠肺組織手動勻漿并用Trizol試劑溶解，提取出RNA，用核酸擴增儀擴增成cDNA。用核酸擴增實時定量檢測系統檢測達到一定熒光值得所需要的循環次數(Ct值)。循環次數的標準值用肌動蛋白基因標準化，用ΔΔCt方法計算比較實驗組和對照組基因變化。其中寡核苷酸引物序列如下：Api6上游引物5’-TGG CCA TCT TGA GCA TTT TTG-3’，下游引物5’-GCT GCA CTT TGG TTG GAG ACT-3’；LXRα上游引物5’-CAC GCC TAC GTC TCC ATC AA-3’，下游引物5’-GCA TCC GTG GGA ACA TCA G-3’；β-actin上游引物5’-GGC ACC ACA CCT TCT ACA ATG AG-3’，下游引物5’-GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA G-3’。

3.4流式細胞術檢測細胞的凋亡 收集肺泡灌洗液細胞或培養的RAW264.7細胞，孵育在含2 μL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素和2 μL碘化丙啶的100 μL結合液中，室溫孵育15 min，流式細胞術檢測細胞凋亡。收集的信號采用FACScan (Becton Dickinson) 軟件分析。

3.5支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)的純化和收集 麻醉解剖不同飲食飼養的小鼠，將氣管分離并插入一個適配器，用1 mL無菌生理鹽水注入小鼠肺內并收集，重復2次。將收集的約3 mL BALF在260×g離心15 min，取上清，采用ELISA檢測炎癥因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosisfactor α,TNF-α)和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemattractant protein 1,MCP-1)的表達；用1 mL磷酸緩沖液重懸細胞，用網格血細胞計數后送流式細胞室檢測細胞凋亡率。

3.6肺泡II型上皮細胞(alveolar type Ⅱ epithelial cells,ATII細胞)的收集和純化 將不同飲食飼養16周的小鼠麻醉解剖后暴露肺組織，通過肺動脈用注射器注入20 mL生理鹽水進行肺灌洗后，然后在氣管口注入3 mL的分散酶(dispase)并迅速蓋上冰使其凝結；45 min后分離肺組織，放入含10 mL HEPES和DMEM培養基的60 mm培養皿中，在培養基中加入1×105U/L的DNA酶，然后用剪刀等工具分離肺組織細胞；分離出的細胞先后用100 μm孔徑和40 μm孔徑的濾網去除雜細胞，然后將濾過的細胞用血細胞相應的抗體孵育2 h以得到較純凈的ATⅡ細胞；最后將得到的ATII細胞在130×g、4 ℃離心8 min，將收集到的細胞用流式細胞術檢測細胞凋亡率。

3.7RAW264.7細胞的培養和處理 小鼠來源的巨噬細胞株RAW264.7購于ATCC。把RAW264.7細胞培養在含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基中，培養環境是37 ℃、5% CO2。為了確定oxLDL對該細胞的凋亡作用，將細胞培養在無血清培養基中(含0.2% BSA)培養12 h后加入不同濃度的oxLDL(0、50、100、150 mg/L)。為了證實重組的Api6蛋白在oxLDL誘導的RAW264.7細胞的凋亡中可以發揮作用，細胞分別給予150 mg/L oxLDL、500 μg/L重組Api6蛋白和150 mg/L oxLDL加上500 μg/L重組Api6蛋白處理。在培養24 h后收集細胞，用流式細胞術測定細胞凋亡率。

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。各組間均數比較使用單因素方差分析(ANOVA)或t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。使用SPSS 11.0軟件分析。

結 果

1 巨噬細胞在高脂高膽固醇飲食喂養組的肺中蓄積

高脂高膽固醇飲食喂養的小鼠BALF中細胞計數增加，見圖1A。免疫組織化學結果顯示，CD68陽性巨噬細胞呈現泡沫狀，并聚集在高脂高膽固醇喂養的小鼠的肺泡腔內，見圖1B。ELISA檢測高脂高膽固醇飲食組小鼠BALF中TNF-α和MCP-1的表達水平分別為(240.42±6.87)ng/L和(110.83±0.79)ng/L，明顯高于普通飲食組[(192.15±21.90)ng/L和 (81.78±3.69)ng/L,P<0.01]。

Figure 1. Pulmonary inflammaiton induced by 16 weeks of high-fat high-cholesterol diet (HFD/HCD) feeding. A: BALF cells were collected from 3 aliquots of 1 mL sterile normal saline bronchoalveolar lavage, total cell count was determined using a grid hemocytometer.Mean±SD.n=3～5.*P<0.05 vs regular diet (RD). B: immunohistochemical staining of pulmonary macrophages using anti-CD68 antibody (×400). Arrows points to the CD68-positive macrophages.

2 高脂高膽固醇飲食喂養組小鼠BALF細胞凋亡率減少

流式細胞術分析發現，相對于普通飲食組，高脂高膽固醇飲食喂養的小鼠BALF細胞的凋亡率明顯降低，見圖2A。與此相反，ATⅡ細胞凋亡率在普通飲食和高脂高膽固醇飲食組無明顯差異，見圖2B。由于BALF內的細胞大部分是巨噬細胞，因此該結果表明，在高脂高膽固醇飲食喂養16周的小鼠模型中，可以抑制巨噬細胞的凋亡而非ATII細胞的凋亡。

Figure 2. Flow cytometric analysis showed decreased pulmonary macrophage apoptosis in HFD/HCD-fed mice compared to RD-fed mice. Single-cell suspensions were prepared from BALF cells (A) or purified alveolar type II endothelial cells (B) of HFD/HCD-fed or RD-fed mice for FACS analysis. Distribution of annexin V (AV) and/or propidium iodide (PI) positive cells was presented in dot plots and percentage numbers were indicated. AV and PI-double negative cells are defined as live cells. AV-positive, PI-negative cells are defined as early apoptotic cells. AV and PI-double positive cells are defined as late apoptotic and necrotic cells. The analysis was repeated 3 times (n=3) and a representative experiment is shown.

3 高脂高膽固醇飲食喂養的小鼠肺組織中Api6和LXRα的表達增加

高脂高膽固醇飲食喂養小鼠LXRα mRNA和蛋白的表達明顯上調，見圖3A、C。Api6 mRNA和蛋白的表達也明顯增加，見圖3A、B。

Figure 3. Increased expression of pulmonary LXRα and Api6 in HFD/HCD-fed mice compared to RD-fed mice. A: real-time PCR analysis of Api6 and LXRα mRNA expression; B and C: Western blotting for the protein expression of Api6 (B) and LXRα (C) in the lungs. β-actin was used as the internal control.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs RD.

4 重組的Api6蛋白可以抑制oxLDL引起的體外巨噬細胞凋亡

oxLDL處理細胞24 h可以誘導RAW264.7巨噬細胞產生劑量依賴性的凋亡，見圖4A。加入500 μg/L重組Api6蛋白于150 mg/L oxLDL中共同培養，結果表明，重組的Api6蛋白可以有效地保護ox-LDL引起的RAW264.7巨噬細胞的凋亡，見圖4B。

Figure 4. Api6 inhibited the apoptosis of murine macrophage RAW264.7 cells induced by oxLDL. A: dose-dependent manner of oxLDL-induced macrophage apoptosis in vitro. RAW264.7 cells were incubated with various concentrations of oxLDL in serum-free DMEM medium (containing 0.2% BSA). Apoptotic rate of cultured cells was determined after 24 h incubation by flow cytometry analysis. Distribution of annexin V (AV) and/or propidium iodide (PI) positive cells is presented in dot plots and percentage numbers are indicated. B: RAW264.7 cells were treated with oxLDL at 150 mg/L, recombinant Api6 at 500 μg/L and oxLDL plus recombinant Api6 in serum-free DMEM medium (containing 0.2% BSA). Apoptotic rate of cultured cells was determined after 24 h incubation by flow cytometery analysis. Distribution of AV and/or PI positive cells is presented in dot plots and percentage numbers are indicated.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs oxLDL.

討 論

已有的研究結果表明，肺部的慢性炎癥與內源性的膽固醇轉運有很大關系，比如包括腺苷三磷酸結合盒轉運體A1、三磷酸腺苷結合盒亞家族G1、載脂蛋白E基因等敲除小鼠中均有研究報道[7-9]。而我們的研究結果表明小鼠的肺部炎癥同樣在16周的高脂高膽固醇飲食喂養的C57BL/6J小鼠中發生，其主要證據是BALF細胞計數的增加，炎癥因子表達的上調和泡沫狀的巨噬細胞聚集在肺泡腔中(圖1)。然而，這種由飲食誘導的肺巨噬細胞聚集的病理生理意義需要得到進一步研究。

既往研究多探討高膽固醇血癥對特定病原體感染引發的免疫應答的影響。在關于中性粒細胞調節炎癥方面，高膽固醇血癥對于脂多糖或者肺炎克雷伯菌的引起的肺部感染是有損宿主免疫的，主要原因是它可以減少肺泡中性粒細胞的聚集[10]。Smoak等[11]研究表明，LXR的活化受損會影響肺中性粒細胞的聚集從而使小鼠更易受胞外病原體的感染。

與此相反的是，巨噬細胞積極參與細胞內的感染，而且高膽固醇血癥是胞內感染的保護性因素。低膽固醇血癥已被證實是肺結核的主要危險因素[12]。Korf等[13]證實，LXR的配體可以抵抗由結核分枝桿菌引起的胞內感染。當對小鼠處以LXR的受體激動劑時，可以減少結核分枝桿菌的復制。而相反的是，缺乏LXRα和LXRβ基因的LXRα-/-LXRβ-/-雙敲小鼠則表現為對該菌的易感增加和先天性與獲得性免疫的缺陷。

LXRα-/-LXRβ-/-雙敲小鼠同樣也被證實非常易于感染其它胞內細菌，比如單核細胞增生利斯特氏菌、炭疽芽孢桿菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌[7]。LXR或者LXR/RXR的激活可以通過促進一些抗凋亡因子如凋亡抑制因子6(Api6/Spα/AIM)和 Bcl-XL的表達增加，影響胞內細胞感染相關炎癥細胞的凋亡。

我們通過實驗也證實了LXRα和Api6同樣在高脂高膽固醇飲食喂養的C57BL/6J小鼠的肺中被激活(圖3)，它們的激活可以部分解釋由高脂高膽固醇飲食喂養16周引起的C57BL/6J小鼠肺中巨噬細胞的聚集(圖2A)。而在正常生理狀態下，肺泡腔內僅有少量巨噬細胞，巨噬細胞的大量聚集可導致肺內炎癥的發生[14-15]。張麗麗等[16]的研究證實在肝纖維化大鼠肺泡腔內巨噬細胞明顯增加并出現肺組織內TNF-α升高的炎癥反應，而在我們的高脂高膽固醇飲食模型下的肺組織中也出現了以巨噬細胞聚集和TNF-α與MCP-1增高的肺部炎癥反應。

[參 考 文 獻]

[1] Miyazaki T, Hirokami Y, Matsuhashi N, et al. Increased susceptibility of thymocytes to apoptosis in mice lacking AIM, a novel murine macrophage-derived soluble factor belonging to the scavenger receptor cysteine-rich domain superfamily[J]. J Exp Med, 1999, 189(2):413-412.

[2] Haruta I, Kato Y, Hashimoto E, et al. Association of AIM, a novel apoptosis inhibitory factor, with hepatitis via supporting macrophage survival and enhancing phagocytotic function of macrophages[J]. J Biol Chem, 2001, 276(25):22910-22914.

[3] Arai S, Shelton JM, Chen M, et al. A role for the apoptosis inhibitory factor AIM/Spα/Api6 in atherosclerosis development[J]. Cell Metab, 2005, 1(3): 201-213.

[4] Kurokawa J, Nagano H, Ohara O, et al. Apoptosis inhibitor of macrophage (AIM) is required for obesity-associated recruitment of inflammatory macrophages into adipose tissue[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(29):12072-12077.

[5] Lian X, Yan C, Yang L, et al. Lysosomal acid lipase deficiency causes respiratory inflammation and destruction in the lung[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2004, 286(4):L801-L807.

[6] Lian X, Yan C, Qin Y, et al. Neutral lipids and peroxisome proliferator-activated receptor-γ control pulmonary gene expression and inflammation-triggered pathogenesis in lysosomal acid lipase knockout mice[J]. Am J Pathol, 2005, 167(3):813-821.

[7] Baldan A, Gomes AV, Ping P, et al. Loss of ABCG1 results in chronic pulmonary inflammation[J]. J Immunol, 2008, 180(5):3560-3568.

[8] Naura AS, Hans CP, Zerfaoui M, et al. High-fat diet induces lung remodeling in ApoE-deficient mice: an association with an increase in circulatory and lung inflammatory factors[J]. Lab Invest, 2009, 89(11):1243-1251.

[9] Gowdy KM, Fessler MB. Emerging roles for cholesterol and lipoproteins in lung disease[J]. Pulm Pharmacol Ther, 2013, 26(4):430-437.

[10] Draper DW, Madenspacher JH, Dixon D, et al. ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2010, 182(3):404-412.

[11] Smoak K, Madenspacher J, Jeyaseelan S, et al. Effects of liver X receptor agonist treatment on pulmonary inflammation and host defense[J]. J Immunol, 2008, 180(5):3305-3312.

[12] Perez-Guzman C, Vargas MH. Hypocholesterolemia: a major risk factor for developing pulmonary tuberculosis?[J]. Med Hypotheses, 2006, 66(6):1227-1230.

[13] Korf H, Vander Beken S, Romano M, et al. Liver X receptors contribute to the protective immune response againstMycobacteriumtuberculosisin mice[J]. J Clin Invest, 2009, 119(6):1626-1637.

[14] 田曉霞，賈建桃，冀菁荃，等. 肝硬化大鼠肺臟的病理變化[J]. 長治醫學院學報，2009，23(1):7-10.

[15] 賈建桃，張慧英，田曉霞，等. 葡萄糖調節蛋白78在復合致病因素誘導的大鼠肝肺綜合征中的作用[J]. 中國病理生理雜志，2011, 27(8):1580-1585.

[16] 張麗麗，張慧英，王黎敏，等. 大黃素對肝纖維化大鼠肺損傷的保護作用[J]. 中國病理生理雜志，2014, 30(2):291-296.